EBLN2基因对肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制

魏岩冰，韩泽广,2,3

(1上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200025；2国家人类基因组南方研究中心；3上海交通大学系统生物医学院)



EBLN2基因对肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制

魏岩冰1，韩泽广1,2,3

(1上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200025；2国家人类基因组南方研究中心；3上海交通大学系统生物医学院)

目的 探讨人类内源性非逆转录博纳病毒样核蛋白序列2(EBLN2)基因对肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法 采用实时定量RT-PCR技术和蛋白印迹技术检测EBLN2基因在肝癌细胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)和人肝癌组织样本中的表达；选取EBLN2表达水平较低的肝癌细胞株Focus和YY-8103进行外转质粒过表达，Pcmv-EBLN2重组质粒转入肝癌细胞株Focus和YY-8103，24 h观察EBLN2基因过表达对肝癌细胞株细胞增殖、平板克隆形成能力及软琼脂克隆形成能力、细胞周期的影响。结果 定量和半定量PCR实验结果表明EBLN2基因在59%的肝癌样本中表达下调，且在10株肝癌细胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)中表达水平与正常肝组织相比明显下调，依次下调48%、73%、72%、79%、84%、72%、87%、74%、82%、80%，P均<0.05；Pcmv-EBLN2质粒转染肝癌细胞株YY-8103和Focus 24 h后，肝癌细胞株YY-8103和Focus的细胞增殖率分别为72.2%、85.0%，平板克隆形成率分别为52.6%、25.6%，软琼脂克隆形成率分别为40.9%、37.5%，与空白对照相比，P均<0.05；肝癌细胞株YY-8103和Focus从G1期进入S期受到抑制。结论 EBLN2基因在肝癌组织中表达下调，其可能通过调节细胞周期抑制肝癌细胞增殖。

肝细胞癌；人类内源性非逆转录博纳病毒样核蛋白序列2基因；抑癌基因；细胞增殖

肝细胞癌(HCC)是肝癌最常见亚型，占肝癌确诊和致死人数的70%～80%。尽管近年来肝癌治疗手段不断发展，但5年致死率仍约7%[1～5]。因此，研究肝癌发生的分子机制，尤其针对最新发现的癌基因和抑癌基因在癌症发生发展中的作用对肝癌诊断、治疗有重要意义[6, 7]。人类内源性非逆转录博纳病毒样核蛋白序列(EBLNs)基因是最近研究发现的远古时期博纳病毒核蛋白基因整合到人类染色体上并稳定存在的基因家族[8～10]。EBLN2是该家族中的重要成员，在人类和其他哺乳动物中广泛存在。有研究报道EBLN2基因在宿主细胞内可能已进化为有益成分，对宿主细胞起到一定保护作用[11]。然而，该基因在肝癌发生、发展中作用的研究鲜见报道。2014年12月～2015年12月，我们探讨了EBLN2基因对肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验所用肝癌组织均取自上海市第十人民医院病理科肝癌患者手术切除组织块，患者手术前签署知情同意书，并得到国家人类基因组南方研究中心道德理论委员会的批准，离体组织块-80 ℃保存。本实验中所用10株肝癌细胞株HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2均为本中心液氮罐里实验室保存。所用试剂有TRIzol试剂，氯仿，Annexin-V FITC 和PI 双染试剂盒，反转录试剂盒，TaKaRa公司预混Taq Premix polymerase 试剂盒，SYBR Premix ExTaq试剂盒，蛋白质裂解液，琼脂糖，SDS，蛋白质甲巯基乙醇上样缓冲液，Lipofectamine2000，DMEM培养液，胰酶，70%乙醇，磷酸盐缓冲液，20%胎牛血清，碘化丙啶，考马斯亮蓝，RNase。仪器：六孔板，培养皿，EP管，灭菌锅，培养箱，离心机，PCR仪，流式细胞分选仪，移液枪，超净工作台，电泳仪，酶标仪，显微镜。

1.2 组织和细胞RNA提取 采用TRIzol法。称取适量肝癌组织块，在液氮条件下研磨粉末状，取粉末于EP管中，加入TRIzol试剂裂解约15 min，贴壁细胞RNA提取时直接弃去配液并用PBS洗涤，加TRIzol裂解约15 min。然后采用酚-氯仿法抽提RNA，并用酶标仪测定RNA浓度，注意RNA提取过程中无菌操作，所用EP管等为无RNase污染。使用TAKARA公司反转录试剂盒中的SYBR Green Assay试剂，根据试剂盒使用说明书，将2 μg RNA逆转录成cDNA分子，-20 ℃备用。

1.3 EBLN2基因表达检测 采用RT-PCR和半定量RT-PCR法。目的基因EBLN2的RT-PCR引物：上游引物5′-GAACGAGGAAAGGGGTACTCC-3′；下游引物5′-CCAGCCGCAATGCCTATCAA-3′。内参基因β-actin的RT-PCR引物：上游引物5′-AGCGAG-CATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物5′-GGGCACGAA-GGCTCATCATCATT-3′。半定量PCR以cDNA为模板，用TaKaRa公司预混Taq Premix polymerase 试剂，扩增目的片段和内参基因，反应体系：模板1 μL，预混聚合酶7.5 μL，上下游引物各1 μL；双纯水补至15 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；其中EBLN2扩增30个循环，内参基因扩增25个循环。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。实时荧光定量PCR实验用TP800实时定量PCR仪和SYBR Premix ExTaq试剂盒进行。反应体系：预混的荧光Taq复合物12.5 μL；上、下游引物各1 μL；模板2 μL；双纯水补至25 μL。反应条件：95 ℃变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.4 EBLN2蛋白表达检测 采用蛋白印迹实验检测 EBLN2表达。细胞和组织样品用蛋白裂解缓冲液提取蛋白质甲巯基乙醇上样缓冲液后95 ℃使蛋白质变性，然后进行SDS凝胶电泳，检测目的基因蛋白表达。β-actin作内参。

1.5 Pcmv-EBLN2转染肝癌细胞Focus和YY-8103 选取EBLN2表达水平较低的细胞株(Focus和YY-8103)进行外转质粒过表达，Pcmv-EBLN2重组质粒转入肝癌细胞株Focus和YY-8103，细胞转染实验使用Lipofectamine2000转染试剂。Pcmv-EBLN2质粒引物：EBLN2上游引物(Sal I)5′-ACGCGTCGACTATGGGTTATTTTCTTAAATTGTATG-CT-3′；下游引物(Not I)5′-ATAAGAATGCGGCCGCCTAACTTGCGTAGCTTGTGTA-3′。转染前1 d接种适量细胞，使转染时细胞数量达70%左右。以3.5 cm培养皿为例，转染时取5 μL脂质体与250 μL无血清的基本培养基混合，2 μg质粒与250 μL无血清基本培养基混合，室温静置5 min；将上述两种混合液混合并室温静置30 min，加入至无抗生素无血清的培养基细胞中；培养箱培养，约4 h后更换成完全培养基，获得EBLN2过表达肝癌细胞株Focus和YY-8103。

1.6 EBLN2过表达肝癌细胞株细胞增殖的检测 肝癌细胞株Focus和YY-8103转染48 h后接种至96孔板中，每孔接种约3×103个细胞，待细胞贴壁后以24 h为1个检测单位，每孔待测细胞中加入CCK-8 10 μL，培养箱培育1 h，用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度值，绘制生长曲线，计算细胞增殖率。

1.7 EBLN2过表达肝癌细胞株细胞克隆形成率的测算 肝癌细胞株Focus和YY-8103转染48 h后接种到六孔板，每孔约3 000个细胞，用含终浓度为4～8 μg/mL G418的DMEM培养箱培养，每周更换一次培养液，观察2～3周时用考马斯亮蓝染色并拍照，观察整体细胞克隆数目。

1.8 EBLN2过表达肝癌细胞株软琼脂克隆形成率的测算 分别配制1%和2%的低熔点琼脂糖，高温灭菌处理；配制2×DMEM，含20%胎牛血清的2×DMEM和2%的低熔点琼脂糖等体积混合，加入24孔板，每孔500 μL，冰箱放置约10 min至凝固；用胰酶消化细胞，每孔接种约3 000个细胞，细胞悬液与1%的琼脂糖等体积混合；每孔加入500 μL于下层胶上；冰箱放置约10 min；凝固后每孔加入约100 μL普通新鲜配液，培养箱培养约3周，显微镜下观察每个孔的克隆数目并拍照进行统计学分析。

1.9 EBLN2过表达肝癌细胞株细胞周期的检测 采用流式细胞分析仪检测。Pcmv-EBLN2重组质粒转入肝癌细胞株Focus和YY-8103 48 h后用胰酶消化成单细胞，收集到15 mL离心管中离心，用磷酸盐缓冲液洗涤单细胞2～3次；70%乙醇固定细胞；碘化丙啶避光染色10 min，同时加入RNase；上样检测，每个样品收集10万个细胞，进行流式分选。

1.10 统计学方法 采用Graphpad prissm5软件进行数据分析并作图。计量数据以表示，各样本间的差异计算采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝癌细胞株中EBLN2表达比较 定量和半定量PCR实验结果显示EBLN2基因在59%的肝癌组织样本中表达下调，EBLN2基因在HCC细胞株中表达水平较低，10株肝癌细胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2、)中EBLN2蛋白相对表达量依次为0.048±0.000 5、0.073±0.000 5、0.072±0.000 5、0.079±0.000 5、0.084±0.000 5、0.072±0.000 5、0.087±0.000 5、0.074±0.000 5、0.082±0.000 5、0.080±0.000 5。

2.2EBLN2 过表达对肝癌细胞增殖、克隆形成和软琼脂克隆形成的影响 与空白对照相比，肝癌细胞株Focus和YY-8103细胞增殖率分别为72.2%、85%，平板克隆形成率分别为52.6%、25.6%；软琼脂克隆形成率分别为40.9%、37.5%，P均<0.05。

2.3EBLN2过表达对肝癌细胞周期的影响 与空白对照相比，肝癌细胞株Focus和YY-8103细胞停滞于G1期。

3 讨论

目前对于哺乳动物基因插入病毒基因序列的研究已较清晰，即插入片段对病毒具有选择性保护作用。然而，内源性逆转录或非逆转录病毒基因序列插入哺乳动物基因组后在宿主细胞内发挥的作用及其作用机制仍不清晰。

EBLN基因是最新研究发现并命名的一类基因家族，最初由博纳病毒基因整合至多种哺乳动物基因组DNA序列，并在宿主细胞内传递和进化[12,13]。EBLN家族中的部分成员包括完整的开放阅读框，能表达mRNA。在类基因组中包括EBLN1、EBLN2、EBLN3和EBLN4四个成员，其中EBLN1与EBLN2同源性较高，且均能在宿主细胞内翻译出蛋白质分子。最近有报道EBLN2可与细胞内蛋白质AP1S1、TUSC2/FUS1及FANCC相互作用[14]，此暗示EBLN家族成员可能表达功能性蛋白质。而关于EBLN2基因在肺癌样本中表达明显下调甚至消失的报道说明EBLN2可能在宿主细胞内作为抑癌基因起作用；同时，有研究发现EBLN2基因在乳腺癌和宫颈癌中表达亦明显下调[15]。然而对该基因在肝癌中的探究鲜见报道。

本研究发现，EBLN2在肝癌样本中与癌旁组织相比表达明显下调；同时，EBLN2在肝癌细胞系中表达水平较低，提示EBLN2可能在肝癌发生中有一定作用。此外，过表达EBLN2能显著抑制肝癌细胞Focus和YY-8103的生长、克隆形成和软琼脂克隆形成。EBLN2基因过表达后Focus和YY-8103细胞的增殖过程被阻滞于G0～G1期。肝癌细胞的无限增殖和非锚定增殖是恶性肿瘤的重要特性，我们的实验数据表明EBLN2基因能明显抑制肝癌细胞的增殖和非锚定生长过程，EBLN2基因可能在肝癌细胞系中发挥抑癌基因功能。

综上所述，EBLN2基因在人肝细胞内可能已共同化为对宿主细胞有益的抑癌基因，并通过调节细胞周期发挥抑制肝癌细胞株增殖的作用，此为内源性病毒元件与宿主细胞的共同进化提供了科学依据。

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Inhibitory effect of EBLN2 gene on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

WEIYanbing1,HANZeguang

(1RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China)

Objective To study the inhibitory effects of endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2 (EBLN2) gene on proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and its mechimasm. Methods The real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western blotting was used to detect the expression of EBLN2 in HCC cell lines (HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2) and human HCC tissue samples. The overexpression of EBLN2 was carried out in Focus and YY-8103 cells with low expression of EBLN2. The recombinant plasmid pCMV-EBLN2 was transfected into Focus and YY-8103 cells.At 24 h, the effects of overexpression of EBLN2 gene on the proliferation of HCC cell lines, plate clone formation ability, soft agar clone formation ability, and cell cycle.Results The quantitative and semi-quantitative PCR results showed that EBLN2 mRNA expression was down-regulated in 59% HCC samples. Further, compared with the normal hepatic tissues, EBLN2 expression was down-regulated in cell lines such as HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2 with the percentage of 48%, 73%, 72%, 79%, 84%, 72%, 87%, 74%, 82% and 80%, respectively (allP<0.05). After the Pcmv-EBLN2 plasmid was transferred into cell lines YY- 8103 and Focus for 24 h, the proliferation rates of YY-8103 and Focus cell lines were 72.2% and 85%. The plate clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 52.6% and 25.6%, and the soft agar clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 40.9% and 37.5%, and significant difference was found, allP<0.05. The cell cycle transition from G1phase to S phase was inhibited in the YY-8103 and Focus cells.Conclusions EBLN2 is down-regulated in HCC tissues and inhibits the proliferation of HCC cells by regulating the cell cycle.

hepatocellular carcinoma; endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2; tumor suppressor gene; cell proliferation

国家科技重大专项课题(2012zx10001012)。

魏岩冰(1988-)，女，硕士研究生，主要研究方向为肿瘤(肝癌)分子遗传学。E-mail：wyb2013@sjtu.edu.cn

简介：韩泽广(1964-)，男，博士，教授，主要研究方向为肿瘤(肝癌)分子遗传学、基因组学和系统生物学应用。E-mail：hanzg@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.002

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0006-04

2016-06-20)