中波紫外线局部照射治疗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的效果观察

赵红亮，陈敏玮，冷向锋，陈振雨，张维娜，刁婷婷

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266000)

中波紫外线局部照射治疗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的效果观察

赵红亮，陈敏玮，冷向锋，陈振雨，张维娜，刁婷婷

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266000)

目的 观察中波紫外线局部照射治疗大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的效果，并探讨其机制。 方法 将30只大鼠随机分为280 nm组、320 nm组和对照组，均建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的动物模型，280 nm组、320 nm组模型建立后即行280、320 nm人工紫外线照射1次，以后2次/d，每次4 min，持续7 d；对照组皮瓣制备后，不做任何处理。各组大鼠均于术后7 d用坐标贴纸法测定皮瓣成活面积，计算皮瓣成活率；取各组大鼠皮瓣组织制作切片行免疫组织化学染色并测算VEGF阳性表达面积所百分比；用TUNEL法检测各组大鼠皮瓣细胞凋亡率。结果 280 nm组、320 nm组、对照组大鼠皮瓣术后7 d的成活率分别为62.38%±8.64%、54.49%±4.48%、39.61%±4.22%，皮瓣VEGF阳性表达面积所占百分比分别为91.39%±9.29%、70.46%±4.02%、34.97%±3.08%，细胞凋亡率分别为53.06%±5.64%、64.72%±3.73%、32.82%±1.72%。以上指标280 nm组、320 nm组和对照组相比，P均<0.05；280 nm组、320 nm组相比，P<0.05。结论 中波紫外线局部照射治疗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤效果满意，机制可能与其提高皮瓣组织VEGF表达有关。但中波紫外线局部照射会导致皮瓣细胞凋亡率升高，紫外线波长较短者细胞凋亡程度较轻。

中波紫外线;皮瓣;缺血再灌注损伤；血管内皮生长因子；细胞凋亡

皮瓣移植过程中常需要经过较长时间的缺血缺氧期，当缺血再灌注时会发生缺血再灌注损伤，影响皮瓣成活。文献报道，中波紫外线(波长280～320 nm)照射后，可以刺激细胞分泌细胞因子，一方面调节免疫系统从而抑制相关炎性浸润、改善局部微环境，另一方面促进毛细血管的生成[1～4]。本研究观察了中波紫外线局部照射治疗大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的效果，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性Wistar大鼠30只，体质量250～300 g，饲养于SPF级动物实验室。PBS为美国Gibco公司产品，4%多聚甲醛、无水乙醇为上海浩然生物技术有限公司产品，VEGF免疫组化试剂盒、PV6000、DAB、TUNEL检测液购自青岛宏达通生物技术有限公司。280 nm和320 nm波长人工紫外线灯为青岛紫元光电有限公司产品。

1.2 实验动物分组及皮瓣缺血再灌注损伤模型建立、紫外线照射方法 将30只雄性Wistar大鼠，随机分成280 nm组、320 nm组和对照组，各10只，术前禁食1 d，参考Petry和Worthamnde的方法[5]设计大鼠腹部皮瓣。均选用以腹壁浅血管为蒂的3 cm×6 cm大小的岛状皮瓣，用10%Na2S将腹部皮瓣区脱毛备用，用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射行全身麻醉，并常规消毒后掀起皮瓣，皮瓣组织层次达皮下内膜层并充分游离腹壁浅血管至其在股动静脉的发出点，游离发出点附近的股动静脉，置动脉夹，4-0丝线原位缝合皮瓣，6～8 h后打开缝线，取出动脉夹后原位缝合。针刺有出血，提示皮瓣缺血再灌注模型建造成功。280 nm组和320 nm组分别用280 nm和320 nm人工紫外线灯进行照射，术后当天照射1次，以后2次/d，每次4 min；对照组皮瓣缺血再灌注模型制作完成后，不作任何处理。

1.3 皮瓣外观观察及成活率测算 术后每天观察各组大鼠皮瓣的颜色、毛发生长、坏死范围及针刺出血情况等，术后7 d用坐标贴纸法测定皮瓣成活面积，计算皮瓣成活率。皮瓣成活率=成活面积/设计面积×100%。

1.4 皮瓣组织VEGF检测 取各组大鼠相同位置皮瓣下组织，4%多聚甲醛固定24 h，蒸馏水浸泡4 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡，包埋成石蜡，切成厚度5 μm切片，采用二步法行免疫组化染色。所用试剂盒购自青岛宏达通生物技术有限公司，严格按照说明书进行操作。每例标本选取10个高表达视野并拍摄图像，用Image Pro6.0 软件测算每个随机选择的视野VEGF阳性染色面积所占百分比。

1.5 皮瓣组织细胞凋亡率测算 取各组大鼠相同位置皮瓣组织切片常规脱蜡、水化后，加入TUNEL反应混合液(购自青岛宏达通生物技术有限公司)，严格按照TUNEL说明书进行具体操作，DAB染色，苏木素复染，封片待镜检。根据阳性凋亡细胞分布情况，切片于400倍镜下随机选取5个阳性视野，每个视野记数300个细胞中凋亡细胞数，细胞凋亡率=5个视野凋亡细胞总数/1 500×100%)。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠皮瓣外观及成活率比较 术后第3天，280 nm组大鼠皮瓣边缘处出现少许不规则的暗灰色硬痂区，随时间推移，未见明显范围进行性扩大；对照组和320 nm组大鼠皮瓣边缘处出现不同大小的片状暗红色或灰褐色硬痂区，且皮肤纹理变浅，硬痂区针刺出血实验阴性。术后7 d，暗色硬痂及坏死范围增大，皮瓣的坏死区域与成活区域边界较明显，且成活区组织未见明显异常增厚。术后7 d，处死大鼠，在切取标本皮瓣组织过程中，280 nm组和320 nm组大鼠皮瓣区域出血情况比对照组明显多。术后7 d，280 nm组、320 nm组、对照组大鼠皮瓣成活率为62.38%±8.64%、54.49%±4.48%、39.61%±4.22%。280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣成活率和对照组相比，P均<0.05；280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣成活率相比，P<0.05。

2.2 三组大鼠皮瓣VEGF表达比较 280 nm组、320 nm组、对照组VEGF阳性表达面积所百分比分别为91.39%±9.29%、70.46%±4.02%、34.97%±3.08%。280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣VEGF阳性表达面积所百分比和对照组相比，P均<0.05；280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣VEGF阳性表达面积所百分比相比，P<0.05。

2.3 三组大鼠皮瓣细胞凋亡率比较 280 nm组、320 nm组、对照组大鼠皮瓣细胞凋亡率分别为53.06%±5.64%、64.72%±3.73%、32.82%±1.72%。280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣细胞凋亡率和对照组相比，P均<0.05；280 nm组、320 nm组大鼠皮瓣细胞凋亡率相比，P<0.05。

3 讨论

中波紫外线可以穿透病毒外壳、真菌、孢子和其他微生物的细胞壁，破坏DNA或RNA，摧毁核酸复制能力或蛋白质结构，从而达到杀菌消炎的作用，且因其穿透性低仅可引起皮肤黏膜微热的感觉，不会引起皮肤黏膜红斑反应及色素沉着，也不会明确诱发日光皮炎和皮肤癌[6～8]。中波紫外线照射皮肤后，作用于角质形成细胞可产生多种细胞因子，其中主要是VEGF，其对促进血管生成和组织成活起主要作用[4,9,10]。正常的皮肤免疫系统(SIS)包括细胞和体液两部分，与体内其它免疫组织相互作用，共同维持皮肤微环境和躯体内环境的稳定[11,12],而其中表皮角质形成细胞(KC)作为最主要组成细胞，不仅有结构支撑作用，更是SIS的重要组成部分，其在紫外线照射后可分泌IL-1β、IL-6、-IFN-γ、G-CSF、VEGF、MIP-1α、TNF-α以及IL-20等多种细胞因子[1～3]。另外中波紫外线可通过调控多种黏附分子及生长因子受体的表达和功能从而使朗格汉斯细胞表面的分子及角化细胞角化细胞分泌的细胞黏附分子1(ICAM-1)表达减少，进一步影响了T细胞的活化与抗原识别[13,14]。

本研究结果显示，采用280 nm、320 nm中波紫外线局部照射的两组大鼠皮瓣存活率高于对照组，且皮瓣VEGF表达高于对照组，表明280 nm和320 nm中波紫外线均能够提高大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤后的成活率，这一效果可能与中波紫外线局部照射促进皮瓣VEGF表达进而促进皮瓣血管新生有关。280 nm组大鼠皮瓣成活率和VEGF阳性表达面积所百分比高于320 nm组，提示波长280 nm中波紫外线促进皮瓣成活和VEGF表达的效果比波长320 nm者好。

本研究结果显示，采用280 nm、320 nm中波紫外线局部照射的两组大鼠皮瓣细胞凋亡率均高于对照组，表明中波紫外线局部照射也会对皮瓣产生一定的损害[15～18]，280 nm组大鼠皮瓣细胞凋亡率低于320 nm，表明280 nm中波紫外线局部照射导致的皮瓣细胞凋亡程度低于320 nm。

综上所述，中波紫外线局部照射可以提高缺血再灌注损伤皮瓣成活率，其机制可能与其提高皮瓣组织VEGF表达有关。但中波紫外线局部照射会导致皮瓣细胞凋亡率升高，紫外线波长较短者细胞凋亡程度较轻。

[1] Kim SB, Kang OH, Joung DK, et al. Anti-inflammatory effects of tectroside on UVB-induced HaCaT cells [J]. Int J Mol Med,2013,31(6):1471-1476.

[2] Yoshizumi M， Nakamura T， Kato M，et al． Release of cytokines/chemokines and cell death in UVB-irradiated human keratinocytes[J]． Cell Biol Int, 2008,32(11)：1405-1411．

[3] An L， Dong GQ， Gao Q， et al． Effects of UVA on TNF-alpha，IL-l beta，and IL-10 expression levels in human keratinocytes and intervention studies with an antioxidant and a JNK inhibitor[J]． Photodermatol Photoimmunol Photomed， 2010,26(1)：28-35．

[4] Di Girolamo N, Wakefield D, Coroneo MT. UVB-mediated induction of cytokines and growth factor in pterygium epithelial cells involves cell surface receptors and intracellular signaling[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006,47(6):2430-2437.

[5] Petry JJ,Worthamn KA.The anatomy of epigastric flap in the experiment rat[J]. Plast Reconstr Surg,1984,74(5):410-413.

[6] 袁春燕，赵颖.碱性成纤维细胞生长因子与视网膜缺血再灌注损伤[J].青岛大学医学院学报，2003,39(2)：216-217.

[7] Lee E, Koo J, Berger T. UVBphototherapy and skin cancer risk：a review of the literature[J].Int J Dermatol， 2005,44(5)：355-360.

[8] 陈旭，齐蓓，黄丹，等.皮肤免疫系统与光致癌[J].中华皮肤科杂志，2011,44(1)：64-66.

[9] Vourtsis SA, Spyriounis PK, Agrogiannis GD, et al. VEGF application on rat skin flap survival[J]. J Invest Surg, 2012,25(1):14-19.

[10] Xu Y, Shao Y, Zhou J, et al. Ultraviolet irradiation-induces epidermal growth factor(EGFR) nuclear translocation in human keratinocytes[J].J Cell Biochem, 2009,107(5):873-880.

[11] Bos JD.Skin Immune System(SIS)[M]．3rd ed．Boca Raton，Florida：CRC Press，2004:352-353．

[12] Biggs L, Yu C, Fedoric B, et al. Evidence that vitamin D(3)promotes mast cell-dependent reduction of chronic UVB-induced skin pathology in mice[J]. J Exp Med, 2010,207(3):455-463.

[13] Suganuma K, Nakajima H, Ohtsuki M, et al. Astaxanthin attenuates the UVA-induced up-regulation of matrix-metalloproteinase-1 and skin fibroblast elastase in human dermal fibroblasts[J]. J Dermatol Sci, 2010,58(2):136-142.

[14] Freitas FA, Piccinato CE, Cherri J, et al. Effects of pentxyfilline and heparin on reperfusion injury island skin flaps in rats exposed to tobacco[J]. J Surg Res, 2010,164(1):139-145.

[15] 刘红霞，周良，丁振华.紫外线对皮肤角质形成细胞DNA的损伤效应以及白藜芦醇的保护作用[J].实用医学杂志，2015，31(23)：3822-3825.

[16] Reichenberger MA, Heimer S, Schaefer A, et al. Adipose derived stem cells protect skin flaps against ischemia-reperfusion injury[J].Stem Cell Rev, 2012,8(3):854-862.

[17] Qi Z,Gao CJ, Wang YB, et al. Effects of hyperbaric oxygen preconditioning on ischemia-reperfusion inflammation and skin flap survival[J].Chin Med J(Engl), 2013,126(20):3904-3909.

[18] 杨宝琦，赵娜，张福仁.银屑病光疗和光化学疗法的研究进展[J].中华皮肤科杂志，2005，38(3)：195.

山东省自然科学基金资助项目(ZR2014HM113)。

陈振雨(E-mail: zhl_plastic@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.011

R622.1

A

1002-266X(2016)47-0038-03

2016-06-12)