毛细血管瘤患儿增生期和退化期瘤组织中AMPK、mTOR表达对比观察

李娟，俞松，王凯，柳望舒，季一发，甘永桥

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

毛细血管瘤患儿增生期和退化期瘤组织中AMPK、mTOR表达对比观察

李娟，俞松，王凯，柳望舒，季一发，甘永桥

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

目的 对比观察增生期和退化期小儿毛细血管瘤组织中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达，探讨AMPK/mTOR通路在小儿毛细血管瘤消退过程中的作用。方法 收集50例小儿毛细血管瘤患者的瘤组织标本，按照Mulliken分类法24例患儿瘤组织处于增生期(增生期组)，26例患儿瘤组织处于退化期(退化期组)，采用免疫组织化学法检测其中AMPK、mTOR的积分光密度。结果 增生期组AMPK、mTOR的积分光密度分别为33.94±12.78、182.43±47.10，退化期组分别为85.87±19.53、47.22±44.52。两组毛细血管瘤组织AMPK、mTOR积分光密度相比，P均<0.01。50例小儿毛细血管瘤患者瘤组织AMPK、mTOR积分光密度值呈负相关(r=-0.78，P<0.01)。结论 与增生期小儿毛细血管瘤组织相比，消退期小儿血管瘤组织中AMPK表达升高，mTOR表达降低。AMPK/mTOR信号通路参与小儿毛细血管瘤的消退过程。

血管瘤；毛细血管瘤；儿童；5磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；血管瘤分期

毛细血管瘤是血管内皮细胞及周细胞的异常增殖导致的良性血管肿瘤，为儿童最常见的良性肿瘤[1]，历经增生期、消退期及消退完全期3个自然进程。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在小儿血管瘤消退过程中起到重要作用[1]，PI3K/Akt非依赖性途径磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信号通路与多种肿瘤发生发展有关[2～4]，但其与小儿毛细血管瘤消退的关系尚不明确。本研究检测并比较了增生期和消退期小儿毛细血管瘤组织中AMPK、mTOR的表达，探讨AMPK/mTOR信号通路在小儿毛细血管瘤消退中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院2008～2015年间存档的50例小儿毛细血管瘤患者的瘤组织蜡块。患儿中男20例、女30例，年龄4个月～13岁，平均28.3个月。毛细血管瘤分布在颈部35例、背部22例、上臂28例及腹部皮肤11例。患儿术前均未做任何辅助性治疗，因瘤体巨大或增长迅速等原因，家属强烈要求手术切除。标本使用征得家长同意。根据Mulliken分类分为增生期24例(增生期组)和消退期26例(消退期组)。

1.2 毛细血管瘤组织AMPK、mTOR检测方法 采用免疫组化SP法。一抗分别为浓缩型兔抗人/鼠/兔AMPK-a单克隆抗体、浓缩型兔抗人/鼠/兔mTOR单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology Inc生产)。一抗工作浓度1∶50。操作按试剂盒说明书进行。以已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。AMPK以细胞核出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞，mTOR以胞膜出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞。用LICA DM1000研究显微镜观察切片，用LICA DFC 280摄像头进行图像采集，每张切片随机选取10个视野，保证在同等条件下拍照存档。用IPWIN60图像分析软件进行图像分析计算AMPK、mTOR积分光密度(IOD)值，取平均值。

2 结果

增生期组AMPK、mTOR的IOD分别为33.94±12.78、182.43±47.10，退化期组分别为85.87±19.53、47.22±44.52。消退期组毛细血管瘤组织AMPK的IOD低于增生期，mTOR的IOD高于消退期(P均<0.01)。50例小儿毛细血管瘤患者瘤组织AMPK、mTOR的IOD呈负相关(r=-0.78，P<0.01)。

3 讨论

毛细血管瘤是血管内皮细胞及周细胞的异常增殖导致的良性血管肿瘤，为儿童最常见的良性肿瘤[5]，历经增殖期、消退期及消退完全期3个自然进程。小儿毛细血管瘤消退与否，主要取决于调控血管内皮细胞增殖或凋亡信号传导通路的变化情况。mTOR为多条信号通路的交汇点，是调节细胞生长和增殖的关键分子。基因改变或信号通路传递异常，可激活mTOR，活化的mTOR磷酸化下游核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)及真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)促进蛋白质翻译，使细胞周期从G1期直接进入S期并大量增殖，毛细血管瘤进入增生期。而当mTOR/p70S6K信号通路受到抑制时，mTOR活化受阻，抑制p70S6K及4E-BP1磷酸化，从而抑制蛋白质翻译，导致细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡，毛细血管瘤进入消退期[6,7]。

AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由α催化亚基，β、γ调节亚基组成的异源三聚体[8]。AMPK在真核生物中具有高保真性，能够保守地调节细胞低能量状态，被认为是“细胞能量调节器”。AMPK通过感知外环境变化，如细胞间压力改变、营养夺获、缺氧或受二甲双胍调节使得一磷酸腺苷浓度增加，而被激活[9]。PI3K/Akt非依赖性途径AMPK/mTOR信号通路通过感知AMP/ATP比值实现对mTOR的负性调控[10]。当肿瘤细胞迅速增殖，细胞间压力改变且依赖有氧糖酵解途径消耗大量能量，AMP/ATP比值增加，AMPK/mTOR信号通路被激活[11]。与PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用相反，活化的AMPK可通过直接激活TSC1/2复合体，下调mTORC1复合体活性。而缺乏TSC2的细胞可通过AMPK磷酸化Raptor亚基上的两个保守的苏氨酸位点诱导14-3-3结合，使Raptor脱离mTORC1复合体，下调mTORC1活性[12～15]。

研究表明，抑制mTOR表达或减低mTOR的活性可使下游的4EBP1、p70S6K、RSK及eIF4G1磷酸化受阻，蛋白质合成受到抑制，最终导致细胞周期阻滞并触发凋亡，血管瘤消退[6,7]。尉娜等[16]发现激活状态的AMPK/mTOR信号通路，可抑制血管内皮细胞增殖及代谢，并促进血管内皮细胞凋亡。本研究结果显示，增生期毛细血管瘤组织AMPK表达低于消退期，mTOR高于消退期，提示在毛细血管瘤增生期，血管内皮细胞大量增殖和能量代增强使组织处于缺氧状态，AMPK系统被激活，导致活化AMPK在细胞中呈高表达，进而抑制mTOR表达，并使其下游分子磷酸化过程受阻，进而抑制蛋白质合成，将细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制血管内皮细胞的增殖、代谢，诱导细胞凋亡，进而使毛细血管瘤消退。

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