肝纤维化的血清学诊断研究进展*

刘婷　综述，徐铭益　审校

肝纤维化的血清学诊断研究进展*

刘婷综述，徐铭益审校

肝纤维化是各种不同病因慢性肝病向终末期肝病进展的必经阶段。近年来，肝纤维化的血清学诊断因其无创性和重复性好而得到广泛的重视。肝纤维化的血清学诊断包括血清常规肝纤维化标志物、血清诊断模型、组学和基因学等方法，而两种或两种以上的血清学诊断方法和模型的联合应用将有助于提高肝纤维化及肝硬化的诊断准确性，从而试图避免临床肝活检。

肝纤维化；血清学标志物；诊断

【Abstract】Liver fibrosis is an inevitable process of chronic liver diseases with different causes which might lead to end-stage liver diseases.In recent years，the serologic diagnosis of liver fibrosis gets widely attention for its non-invasiveness and good repeatability.The serologic diagnosis of liver fibrosis includes conventional serologic markers，serologic diagnostic models，omics，genetics，and the joint application of two or more methods.

【Key words】Liver fibrosis；Serologic markers；Diagnosis

肝纤维化是各类致病因子持续作用下机体的“防御反应”。正常肝细胞的变性坏死激活肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）活化为成纤维样细胞，细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）合成增多、降解减少，最终导致肝功能的降低，肝脏生理结构被破坏。经皮肝脏穿刺活组织检查仍然是目前诊断肝纤维化的“金标准”，但因其存在有创性、取样误差以及不同观察者间的偏倚，尤其肝活检无法用于动态监测肝纤维化程度的变化及抗病毒疗效评估，血清标志物和影像学等无创性肝纤维化诊断技术便应运而生。这些技术包括生物性（血清标志物）、物理性（影像学检查）、生理性（呼气试验）等[1]，其中血清标志物可以对肝纤维化进行早期诊断和动态观察。理想的肝纤维化血清学诊断分子应具备以下特点：（1）对肝脏的特异性高；（2）不受肝、肾和网状内皮细胞廓清的影响；（3）能反映细胞外基质合成和降解的动力学平衡；（4）有助于诊断临床显著性肝纤维化并监测其进程和对治疗的反应；（5）易测定并具有良好的可重复性。

1　血清肝纤维化标志物

肝纤维化血清标志物主要分为间接和直接标志物两大类。间接标志物包括血清天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine transamin ase，ALT）、凝血功能和血小板计数等，它们能反映肝功能的变化，但无法准确地反映肝纤维化程度。

目前，应用较多的直接标志物有透明质酸（Hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前胶原氨基末端肽（Procollagen type III amino-terminal peptide，PIllNP）、I型和IV型胶原、层粘连蛋白（Laminin，LN）、基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase，MMP）和金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），金属蛋白酶和解聚素复合物（Adisintegrin and metalloproteinase，ADAM）。已知的直接标志物因其具有较多缺陷而无法成为理想的诊断肝纤维化的指标：（1）反应基质代谢的速率并且在有明显的炎症活动时趋于更高水平，因此在有轻微的炎症出现时，大量的基质沉积可能不会被检测出来；（2）都没有肝脏特异性；（3）受自身代谢、清除或分泌因素的影响等[2]。HA是反映肝脏ECM的最佳单项指标，它能反映慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C，CHC）和酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）患者的肝纤维化程度。此外，肝细胞膜分泌一类调节基质降解蛋白（MMP，TIMP和ADAM）与肝纤维化的发生和ECM降解密切相关，可用于评估肝纤维化程度[3～6]。Boeker et al提出血清TIMP-1预测早期肝硬化的灵敏度达100%，特异度为56%～75%[7]。但总体而言，单一血清标志物的敏感性和特异性低，仍然没有一项血清纤维化标志物能准确评估肝纤维化程度而应用于临床。

2　血清诊断模型的建立

为了提高血清学无创诊断的效率，近10年国内外学者建立了多种基于血清多项指标的诊断模型。应用于慢性丙型肝炎肝纤维化的无创诊断模型主要有Fibrometer、APRI、Hepascore、FibroTest、Fibrospect、MP3、FPI、ELF、FIB-4、Fibroin dex、FibroSure等，在临床上有充分立足点的无创性诊断模型有APRI和FibroTest，而分类准确率较好（超过80%）的只有Fibrometers（82%）和Hepascore（92%）[8]。值得一提的是，联合使用2～3种血清诊断模型可有效提高诊断准确性。这些模型具备一些共同的特点：（1）受试者工作特征曲线下面积（Area under receiver operating characteristic，AUROC）大于0.8；（2）指标易在临床实践中获取；（3）先后经临床病理验证有一致性较高的诊断准确性、敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值；（4）对判别有或无明显纤维化（S0-1/S2-4）具有较可靠的参考价值。由于每个诊断模型选取的血清学指标并不一致，因此在诊断效率中各有偏颇。研究表明，在明显肝纤维化的诊断中，FibroTest、Forns和Fibrometer的AUROC分别可达到0.89、0.91和0.89[9～11]；在肝硬化（S4期）的诊断中，FibroTest、Hepascore和Fibrometer的AUROC分别可达到0.92、0.93和0.80～0.94[12]。

不同致病因素所致肝纤维化的病理特点各有不同，因此需根据不同病因选择合适的诊断模型。国内最常见的是在慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）所进行的研究。上海肝纤维化组模型（SLFG）在诊断HBeAg阳性的CHB患者明显肝纤维化的AUROC可达到0.84，阳性预测值为91.1%，阴性预测值为51.6%，特异性为95.2%[13]。若将N-聚糖联合SLFG应用于进展期肝纤维化的诊断，其AUROC可达0.90[14]。针对HBeAg阴性的CHB患者，我们课题组建立的模型（性别、年龄、PT、血小板、胆固醇和GGT）在诊断明显肝纤维化患者的AUROC为0.86[15]。为了简化诊断模型，Zhou et al建立的S指数在诊断明显肝纤维化患者的AUROC为0.81[16]。有研究将FibroTest和APRI联合应用于CHB的明显肝纤维化诊断，可提高诊断效率，诊断准确率可达97%[17]。CHC是病毒性肝炎所致肝纤维化的另一重要病因，一项以2000例CHC患者作为研究对象的大样本诊断试验研究表明APRI联合FibroTest的序贯诊断法可使50%明显肝纤维化患者和80%肝硬化患者避免肝活检[18]。此外，一项200例酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）队列研究进行了为期8年的随访，研究结果表明FibroTest、Fibrometer和Hepascore对疾病进展、治疗效果及预后评估均具有重要的价值[19]。非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝纤维化形成的另一重要致病因素。一项研究纳入196例NAFLD患者为研究对象，研究结果表明ELF在区分严重肝纤维化患者（S3-4期）的AUROC可达0.90，区分明显肝纤维化（S2-4期）患者AUROC为0.82，区分有无肝纤维化患者的AUROC为0.76[20]。ELF在预测原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis，PBC）患者肝硬化（Ishak评分5-6）和肝纤维化（Ishak评分3-6）中的AUROC分别为0.76和0.75[21]。在代谢性肝病中，以HA联合转铁蛋白诊断肝硬化的敏感性和特异性高达100%[22]。

总体来说，无创血清学诊断模型的优点有:（1）无创性；（2）血清学多指标能更全面地反映患者的整体状态，减少脂肪、体质量、腹水等自身因素的干扰；（3）易于反复多次检测，便于患者在治疗过程中的复查和随访；（4）与肝组织活检相比无论是风险性或者是费用都更容易被患者所接受。但随着国内外学者对无创血清学模型的深入研究，缺点也逐渐显现：（1）肝纤维化无创血清诊断模型的应用缺乏统一的评价标准；（2）缺乏统一的选择标准；（3）诊断的可靠性尚不明确；（4）计算比较繁琐。

3　新的血清诊断标志物探索性研究

3.1组学近十年来，组学在生物医学研究领域中发挥着越来越重要的作用。（1）蛋白质组学：我们课题组2013年采用蛋白质组学的二维凝胶电泳联合质谱多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）定量检测126例CHB患者血清，筛选出血清转铁蛋白分子等3个小分子蛋白在诊断明显肝纤维化（≥S2期）的AUROC是0.848～0.966；诊断严重肝纤维化（≥S3期）的AUROC是0.785～0.875[23]；（2）糖组学：我们课题组2012年选取146例CHB患者，经肝活组织病理学诊断明确肝纤维化程度，检测血清N－糖组图谱[24]，每份血清均可测得具有10个峰左右的糖组图谱，将峰值量化，得到诊断肝纤维化的血清N－糖组峰标记，通过观察AUROC较高的峰出现的位置可以预测肝纤维化的程度。因此，血清糖组学可以作为一种非创伤性诊断方法，能高效预测CHB患者肝纤维化程度；（3）多肽组学：我们课题组2013年应用血清多肽组学法筛选反映CHB患者肝脏炎症分级的多肽诊断标记物[25]。在126例CHB患者，采用液相色谱法串联质谱法（LC-MS/MS）分离和筛选血清差异多肽峰。应用MRM分析血清差异多肽分子m/z520.3离子与肝纤维化和炎症程度及与病毒载量的关系，结果发现血清DAK多肽分子m/z 520.3可作为CHB患者肝纤维化分期的诊断标记物，但其在CHB人群中的诊断价值还需行大样本研究进一步验证。

3.2基因学肝纤维化的基因学研究也有助于基因诊断标志物的筛选。（1）微小RNA（microRNA，miRNA）：近年来多个研究显示，miRNA在肝脏疾病中呈差异性表达，提示miRNA可能参与调控肝脏疾病的发生、发展或转归。Venugopal et al[26]采用胆管结扎法建立大鼠肝纤维化模型，应用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒从HSC中分离得到包括miRNA在内的总RNA，进一步纯化后进行miRNA水平谱分析，发现在肝纤维化模型动物肝星状细胞miRNA-150和miRNA-194水平下调，而其水平升高可使α-SMA和Ⅰ型胶原表达下降，推测这2个miRNA可作为肝纤维化诊断及治疗靶向标志物。Guo et al[27]发现，在肝星状细胞活化过程中有12个miRNA水平上调，9个miRNA水平下调，其中miR-15b和miR-16可直接诱导肝星状细胞凋亡。Murakami et al[28]用CCl4进行小鼠腹腔灌注建立肝纤维化模型，分别取4周、6周、8周小鼠肝组织进行miRNA水平谱检测，发现miR-199a、miR-200a和miR-200b水平与肝纤维化分期呈一致性的改变，其水平升高可使肝星状细胞中的纤维化相关基因的表达明显增加，推测这些miRNA可作为肝纤维化诊断及治疗的靶点。Ninomiya et al[29]在研究10例PBC患者、5例CHB患者、5例CHC患者、5例健康志愿者血清miRNA水平谱时发现，与健康对照组相比，PBC患者血清has-miR-505-3p、197-3p、500a-3p水平显著降低。与病毒性肝炎患者相比，PBC患者血清has-miR-505-3p、139-5p和197-3p水平显著降低，因此下调的血清has-miR-505-3p和miR-197-3p可以作为PBC临床检测的生物标记物。虽然miRNA的研究近几年取得很大的进展，为肝纤维化的早期无创诊断提供了新思路，但miRNA水平谱检测方法存在较大的差异性，包括生活环境、人种、遗传等，均可导致极大的差异。因此，该研究距临床应用还有待大样本验证其准确性。（2）信使RNA（Messenger RNA，mRNA）：我们课题组在2013年报道了采用基因芯片技术对139例CHB患者的队列肝组织mRNA基因水平谱检测分析，也发现在肝纤维化组（S1～S4组）与无肝纤维化组（S0组）比较，存在多达1451个差异基因[30]。今后，我们将进一步验证筛选肝纤维化相关分子，并进行血清学验证。

4　未来的肝纤维化血清诊断标志物

肝纤维化的诊断涉及病原学、临床、生物化学、影像学和组织病理学等各方面的评定。目前，仅依靠某种或某几类指标或方法诊断肝纤维化显然是不够全面的，还不能满足现今的临床研究的需要。新一代基因组技术是评估肝纤维化动态演变过程的新兴工具。然而，应用这种复杂的、相对昂贵的方法是比较困难的，限制了其在临床上的应用。分子病理学技术在建立的动物模型中的持续发展使其成为识别肝纤维化新型生物标志物的一种有前途的方法。例如，激活的胆管细胞和肝星状细胞的表面受体代表可行的小分子成像目标配体，有利于肝纤维化发生的定量，并且为生物标志物评估提供了一种改进的应用标准[31]。高通量基因分型技术的最新进展和成本下降使得越来越多的全基因组相关研究被用于评估疾病的进展。例如，肝硬化风险评分中包括一种基于七个单核苷酸多态性的算法，并且在慢性丙型肝炎患者中与疾病进展有关[32]。然而，在预测临床因素或其他相对简单标记与疾病进展的关系存在临界值差异，缺乏非白种CHC人群、其他慢性肝病、中间阶段疾病和HIV/HCV合并感染患者的验证，限制了肝硬化风险评分在临床上的应用。基因编码的多态性与CHC患者肝纤维化进展有关[33]，多个全基因组和候选基因的相关研究试图确定NAFLD发病机制中基因组的作用。然而，在不同人群的NAFLD患者中，只有I148 M仍然与疾病严重度和进展有关[34]。血浆蛋白分析有可能识别与翻译后修饰相关的新型肽，有助于慢性肝病的新型生物标志物的发现。复杂的血浆蛋白变化范围、候选标志物的应用、成本问题、样本表型的变化、损耗方法、技术再现性和高通量的能力仍然需要去解决。虽然迄今为止蛋白分析在几项研究中已经被评估，但是诊断的准确性尚无明显的提高[35]。

尽管在此领域已有不少的研究进展，但现有的资料表明，肝纤维化非创伤性诊断方法或预测模型对组织学分期诊断尚未建立起一个等价体系，尚不能完全取代肝活检，而两种或两种以上非创伤性诊断方法和模型的联合应用将有助于提高肝纤维化及肝硬化的诊断率，避免临床肝活检的需要。相信在不久的将来，用新的研究方法可探索出特异性强、能反映肝纤维化程度的血清学指标，并建立起简便易行和准确度高的诊断及评估体系，从而使慢性肝病肝纤维化的防治迈上新的台阶。

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（收稿：2015-11-03）

（本文编辑：陈从新）

Serologic diagnosis of liver fibrosis

Liu Ting，Xu MingYi.
Department of Gastroenterology，First People’s Hospital，Jiao Tong University，Shanghai 200080

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.01.036

国家自然科学基金面上项目（No.81570547）；国家科技部十二五科研项目（No.2012ZX10002007-001-040& 2013ZX10002004-002-003）；医院优秀青年人才计划项目（No. 061405）

200080上海市交通大学附属第一人民医院消化科

刘婷，女，硕士研究生。主要从事肝纤维化、肝硬化和肝癌的临床和基础研究。E-mail:372778250@qq.com

徐铭益,E-mail:xumingyi2014@163.com