射频消融术治疗原发性肝癌患者外周血淋巴细胞和NK细胞的变化

赵素斌，张小芳，李守霞

射频消融术治疗原发性肝癌患者外周血淋巴细胞和NK细胞的变化

赵素斌，张小芳，李守霞

目的观察肝癌患者经射频消融（RFA）治疗后外周血淋巴细胞亚群和NK细胞的变化，探讨射频消融术对肝癌患者免疫功能的影响。方法采用射频消融治疗仪治疗原发性肝癌患者66例，采用流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群和NK细胞的变化。结果在RFA治疗4 w后，患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值和CD16+CD56+细胞百分比分别为（73.3±11.3）%、（41.3±12.5）%、（1.8±0.5）和（18.9±6.1）%，较RFA治疗前的（60.3±9.7）%、（31.5±10.6）%、（1.5±0.6）和（10.1±5.0）%均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CD8+和CD19+细胞百分比略升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论原发性肝癌患者细胞免疫功能处于抑制状态，RFA治疗可以激发机体细胞免疫功能，调节淋巴细胞亚群，升高NK细胞，从而改善患者的免疫抑制状态。

原发性肝癌；射频消融；淋巴细胞亚群；流式细胞术；NK细胞

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Radiofrequency ablation；Flow cytometry；Lymphocyte subsets；NK cells

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前国内外最常见的恶性肿瘤，其死亡率位居各种恶性肿瘤的前列[1]。射频消融术（Radiofrequency ablation，RFA）是近年来治疗原发性肝癌的一种微创技术，具有疗效确切、操作简便、安全性高、组织损伤小、术后并发症少、可重复操作等优点[2]。射频消融术在治疗肿瘤的同时可以促进机体产生抗肿瘤免疫，提高肿瘤患者的生存期[3，4]。本研究回顾性分析了66例接受RFA治疗的原发性肝癌患者在RFA治疗前后外周血淋巴细胞亚群和NK细胞的变化，现报告如下：

1　资料与方法

1.1病例来源2012年6月～2014年12月在邯郸市中心医院和河北工程大学附属医院诊治的原发性肝癌患者66例，男40例，女26例；年龄30～79岁，平均年龄（52.6±7.9）岁。符合原发性肝癌的诊断及临床分期标准[5]。入选标准：肿瘤直径2～6 cm，肿瘤数目1～4个，无门静脉或下腔静脉癌栓，无肝外转移灶，肝功能Child A级36例，B级30例[6]。所有患者签署知情同意书。

1.2仪器和试剂使用西门子Acuson Sequoia 512彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为2～10 MHz，配备有探头穿刺架；使用北京博莱德光电技术开发有限公司生产的多极射频肿瘤消融系统（RFA-Ⅱ型)；使用美国BD Biosciences公司生产的FACS Cabibur双激光四色流式细胞仪和Calibrite四色校准微球试剂盒（NO:340486/NO:340487）；鼠抗人CD3+/APC、CD4+/FITC、CD8+/PE、CD16+/PE、CD56+/PE和CD19+/FITC单克隆抗体、溶血素均购自美国BD Biosciences公司。

1.3 RFA治疗根据患者病变部位的不同，分别采取仰卧位或者俯卧位，在B超引导下向癌灶内插入针形电极，彩色多普勒超声观察肿瘤与周边脏器关系，确定穿刺部位。建立静脉通路，肌肉注射度冷丁和安定。根据患者肿块大小及部位，选择适当的RFA电极（RFA-1312或RFA-1315），消毒、铺巾，用无菌袖套包扎穿刺探头及连接线，寻找最合适的进针线路。将RFA电极针刺入肝脏，到达肿瘤组织内，观察周围有无需要避让的大血管或者胆管、胆囊等，明确针尖位置，将RFA装置输入功率调为650 w，最大输出功率200 w，射频工作频率330 kHz，负载阻抗无感电阻50 Ω，负载功率200 w，凝血输出的最大功率150 w，消融温度自动控制为（90±2）℃，消融时间为12～20 min，消融范围≥R（肿块直径）+1.5 cm，打开微电极，接通射频电流后，消融肿瘤。直径<5 cm的靶肿瘤将全部被强回声掩盖，将3～5 cm靶肿瘤及其周边血管行微波硬化处理。

1.4 T淋巴细胞亚群检测空腹抽取外周血2～3ml，EDTA-K2抗凝，加入荧光抗体10μl至流式细胞仪专用试管底部，再加入抗凝血100μl，低速混匀3 s，室温避光静置15～20 min；加入溶血素2 ml，低速混匀，室温避光静置10～12 min，待红细胞完全裂解后，300 g离心5 min，弃上清液；加入PBS 2 ml洗涤，低速混匀，300 g离心5 min，弃上清液；加入含1%多聚甲醛的PBS 250μl，低速混匀，上机检测CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+和CD19+细胞百分比。在检测时设同型对照。

1.5统计学方法应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1临床效果66例患者接受RFA治疗后，随访3～10个月，完全缓解6例（9.09%），部分缓解30例（45.5%），病情稳定17例（25.7%）。13例（19.7%）术后相继出现肝内新发病灶。2.2 RFA治疗前后外周血淋巴细胞和NK细胞的变化治疗后患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD16+CD56+细胞百分比较RFA治疗前均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CD8+和CD19+细胞略升高，但差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1　66例患者RFA治疗前后外周血淋巴细胞和NK细胞(%，x±s)的变化

3　讨论

HCC的发生发展与机体的免疫功能失调密切相关。肝癌患者细胞免疫功能低下，处于免疫抑制状态，正常的免疫功能遭到破坏[7，8]。近年来，RFA应用广泛，技术发展迅速，国内外报道明显增多[9，10]。有研究显示[11，12]，与手术切除相比，RFA术后肿瘤坏死组织吸收进入血液后，可作为内源性抗原激发机体的抗肿瘤免疫，提高机体抗肿瘤免疫应答。HCC经RFA治疗后，可影响淋巴细胞亚群分布，使患者免疫功能得到改善。有报道表明[13]，RFA术后联合应用干扰素治疗，可进一步提高生存率，明显降低肿瘤转移及复发率。RFA主要通过3种途径发挥抗癌作用:①直接杀伤恶性肿瘤细胞，诱导细胞毒性T细胞的产生，增强细胞免疫功能；②经热疗后暴露肿瘤细胞表面抗原或增强肿瘤抗原性，参与肿瘤抗原呈递，激发细胞免疫；③热疗致使局部产生免疫反应。T细胞介导的细胞免疫是体内免疫系统中主要的抗肿瘤免疫。CD3+细胞为成熟T淋巴细胞表面的膜分子，基本可以反映外周血T淋巴细胞的总量。CD4+细胞为辅助性T淋巴细胞，通过释放细胞因子激活巨噬细胞、NK细胞，参与抗肿瘤免疫效应。CD8+为细胞毒性淋巴细胞，通过细胞裂解和细胞凋亡直接杀死肿瘤细胞，而保持CD4+/CD8+比值平衡对调节细胞免疫和维持机体的免疫功能有着重要作用。因此，通过检测淋巴细胞亚群和NK细胞水平，可在很大程度上反映机体的免疫功能。

本研究结果表明，原发性肝癌患者在RFA治疗后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和NK细胞水平与治疗前比较均明显升高，差异有统计学意义；CD8+、CD19+水平略升高，但差异无统计学意义，与有关报道结果基本一致。

RFA治疗原发性肝癌，不仅可以消除局部肿块活性，还可以改善机体免疫抑制状态，增强机体的免疫功能。淋巴细胞亚群的检测对于指导肿瘤综合治疗、观察疗效、判断预后具有重要的临床意义。

[1]Williams JP，Yamamoto S，Raman SS，et al. Percutaneous ablation of hepatocellular carcinoma:current status. J Vasc Interv Radiol，2010，21（Suppl 8）:S204-213.

[2]薛平，郑超，曹良启，等.超声联合腹腔镜射频消融术对肝癌患者免疫功能的影响.临床医学工程，2012，19（10）:1637-1640.

[3]扈彩霞，郑加生，钱智玲，等.原发性肝癌患者射频消融前后外周血T淋巴细胞绝对值变化的临床意义.北京医学，2011，33: 451-453.

[4]Shiina S，Tateishi R，Arano T，et al.Radiofrequency ablation for hepatocellularcarcinoma：10-yearoutcomeandprognostic factors.Am J Gastroenterol，2012，107：569-577.

[5]邱少敏，彭鹏，宋玉华，等.肝癌患者血清趋化因子配体18的检测及其意义.现代生物医学进展，2012，12（22）：4275-4280.

[6]中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝胆病杂志，2001，12（9）：324-325.

[7]Neumann-Haefelin C，Btam HE，Chisari FV，et al.T cell responge in hepatitis C virus infection.J Clin Virol，2005，32（2）：75-85.

[8]Alessandro Z，Massimo P，Amalia P，et al.Radiofrequency thermal ablationofhepatoeellularcarcinomalivernodules responses. Cancer Res，2006，66（23）：1139-1146.

[9]Salama IA，Korayem E，ElAbd O，et al.Laparoscopic ultrasound withradiofrequencyablationofhepatictumorsincirrhotic patients.J Laparoendosc Adv Surg Tech，2010，20（1）：39-46.

[10]Simo KA，Sereika SE，Newton KN，et al.Laparoscopic-assisted microwaveablationforhepatocellularcarcinoma：safetyand efficacyincomparisonwithradiofrequencyablation.JSurg Oncol，2011，104（7）：822-829.

[11]EishiroM，YasunariN，KuniakiA，etal.Enhancementof tumor-specificT-cellresponsesbytranscatheterarterial embolizationwithdendriticcellinfusionforhepatocellular carcinoma.Int J Cancer，2010，126（9）：2164-2174.

[12]WidenmeyerM，ShebzukhovY，HaenSP，etal.Analysisof tumor antigen-specific T cells and antibodies in cancer patients treated withradiofrequency ablation.IntJ Cancer，2011，128（11）：2653-2662.

[13]ShimomuraS，IkedaN，SaitoM，etal.Long-terminterferon therapyafterradiofrequencyablationiseffectiveintreating patients with HCV-associated hepatocellular carcinoma.Hepatol Int，2010，5（1）：559-566.

（收稿：2015-03-30）

（本文编辑：陈宗炳）

Effect of radiofrequency ablation on peripheral blood lymphocytes and NK cells in patients with hepatocellular carcinoma

Zhao Subin，Zhang Xiaogfang，Li Shouxia.Third
DepartmentofSurgery，AffiliatedHospital，HebeiUniversity of

Engineering，Handan 056001，Hebei Province

10.3969/j.issn.1672－5069.2016.01.028

056001河北省邯郸市河北工程大学附属医院普外三科（赵素斌）；邯郸市中心医院检验科（张小芳，李守霞）

赵素斌，男，主任医师。主要从事肝胆外科学研究。E-mail:laopoaini777@sina.com

李守霞，E-mail:xiaofang1118@126.com