大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究

陕西中医药大学医学技术系 (咸阳 712000)

耿朝萌 　刘林波　郭瑞林△　苏　冰△ 　张晓雪△



·临床检验·

大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究

陕西中医药大学医学技术系 (咸阳 712000)

耿朝萌 刘林波郭瑞林△苏冰△张晓雪△

摘要目的：刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验检测大肠埃希菌生物膜的敏感性和特异性比较。方法：对临床分离的83株大肠埃希菌进行生物膜形成实验，分别经刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验，随机抽取25株进行激光共聚焦显微镜(CLSM)观察。结果：临床分离的83株大肠埃希菌经刚果红-阿利新蓝联合染色阳性率37.3%，敏感性81.8%，特异性100%；半定量粘附实验阳性率45.8%，敏感性100%，特异性78.6%；两种检测方法比较差异无统计学意义。结论：刚果红-阿利新蓝联合染色、半定量粘附实验均可用于大肠埃希菌生物膜的检测。

主题词@大肠埃希菌生物膜/细胞学刚果红-阿利新蓝联合染色细菌粘附染色与标记显微镜检查，共焦比较研究

细菌生物膜形成在细菌感染中的作用已引起广泛关注，对生物膜的检测也得到了越来越高的重视，出现了各类不同的检测方法[1-5]。本文对我院临床分离的83株大肠埃希菌在体外能否形成生物膜进行实验，并分别采用刚果红-阿利新蓝联合染色，半定量粘附实验，比较其阳性检出率、敏感性和特异性，对其临床意义进行探讨，现报告如下。

资料与方法

1实验菌株、主要试剂与仪器收集2014年8～11月陕西中医药大学第二附属医院临床标本中分离的83株大肠埃希菌，删除同一患者相同感染部位分离的重复分离菌株，所有菌株均经临床鉴定。LB肉汤，刚果红(中国远航试剂厂)，阿利新蓝8GX(上海如吉生物科技有限公司)，结晶紫为国产分析纯，光学显微镜(OLYMPUS)，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8),全自动酶标仪等。

2 方法

2.1刚果红-阿利新蓝联合染色:

2.1.1阿利新蓝染液：阿利新蓝2 g，冰醋酸3 ml，蒸馏水97 ml，用前过滤；刚果红染液：刚果红 0.5g，50%酒精100 ml。

2.1.2刚果红-阿利新蓝联合染色：将少量的无菌生理盐水滴于经高压灭菌的载玻片上，从血平板上挑取少许活化的菌落与之混匀，再滴加阿利新蓝染液,室温下静置10～20min后，经火焰干燥后再滴加少许刚果红染液，涂布均匀,室温下染色5min,用蒸馏水冲洗至无染料流下为止，滤纸吸干后油镜下观察。重复实验3次。

结果判断：形成生物膜的细菌为淡红色，胞外多糖等为深红色，细胞之间边界不清，深红色的胞外多糖聚集成团并包裹于菌体周围。

2.2半定量粘附实验: 参照文献[1]方法进行，重复实验3次。

2.3激光共聚焦显微镜: 随机抽取25株大肠埃希菌，参照文献[5]进行CLSM扫描。

2.4统计学方法：运用SPSS19.0统计学软件，采用χ2检验，检验标准α=0.05。

结果

1两种方法对大肠埃希菌生物膜的阳性检出率83株临床分离的大肠埃希菌中，经刚果红-阿利新蓝联合染色实验和半定量粘附实验分别有31株和38株形成生物膜，其阳性率分别为37.3%、45.8%，两种方法的检出率比较差异无统计学意义(χ2=1.21，P>0.05)。

2两种方法敏感性和特异性的比较随机抽取的25株大肠埃希菌经CLSM观察有11株形成生物膜，刚果红-阿利新蓝联合染色实验有9株阳性，半定量粘附实验有11株阳性，随机抽取的25株经CLSM观察有14株未形成生物膜，刚果红-阿利新蓝联合染色实验有14株阴性，半定量粘附实验有11株阴性。两种方法的敏感性与特异性分别为81.8%、100%和100%、78.6%。

讨论

生物膜(Biofilm,BF)是与浮游菌相对应的存在形式，是细菌在生长过程中为适应外界环境，粘附于生物或非生物表面，由自身细胞产生的胞外聚合物(胞外多糖、胞外DNA和蛋白等)及其基质包裹的具有三维结构的菌细胞群体。细菌形成生物膜是引起持续性、反复性感染的常见致病机制，大肠埃希菌形成的生物膜可以引起前列腺炎、胆道感染、导尿管相关性膀胱炎等对人类健康造成极其严重危害的疾病，并与外科手术植入物[6-7]等相关感染有紧密联系。有报道表明细菌生物膜的形成常常也是导致疾病复发和药物治疗失败的重要原因。

生物膜的检测主要有定性、定量检测和形态学观察。主要的检测方法有刚果红-阿利新蓝联合染色、半定量粘附实验[1]、菌落计数法[2]、刚果红实验[3]、银染法[4]、扫描电镜或CLSM[5]的形态学观察。本文对我院临床分离的83株大肠埃希菌在体外生物膜形成能力进行检测，分别采用刚果红-阿利新蓝联合染色、半定量粘附实验，比较其阳性检出率有无统计学差异。随机抽取其中25株，以CLSM观察结果为真阳性标准，检测刚果红-阿利新蓝联合染色，半定量粘附实验的敏感性和特异性。

刚果红作为指示剂的选择培养基被广泛应用于生物膜形成的定性检查，而阿利新蓝在组织细胞化学中常规应用于酸性粘多糖及粘蛋白染色，因此，刚果红-阿利新蓝联合染色应用于细菌胞外糖染色效果较佳。其操作方法相对简便，实验结果易于观察，但阿利新蓝染液的pH值在实验中非常重要，在pH2.5时染色效果最佳，但刚果红在酸性条件下会形成棕黑色沉淀，故在染色过程中滴刚果红染液之前需将阿利新蓝染液中的冰醋酸完全挥发。半定量粘附实验[1]为胞外粘附基质的结晶紫染色法，因其能通过吸光度间接反应生物膜的形成量，而多用于微孔板、试管等小容器中的生物膜的半定量分析。其实验所需试剂及器材成本较低，实验条件要求不高而被一般的临床实验室广泛应用，但对于需动态观察生物膜的形成并不适用。CLSM不仅可以观察到生物膜的形态结构还可以对标本进行断层扫描，再通过三维重建得到标本的立体结构以显示生物膜内部结构，并可与图像处理软件如ISA软件[5]将三维图像数据化，且减少了扫描电镜繁琐的制片过程对生物膜结构的破坏。同时，CLSM也可与荧光原位杂交技术(FISH)相结合，更直观的反应生物膜中活菌与死菌的比例，更真实地反映生物膜形态结构与细菌之间的关系，并可同时检测多种属细菌。但是，CLSM价格昂贵，且实验条件要求较高，难以满足一般临床实验室对生物膜形成能力的评估要求。

大肠埃希菌是多种易形成生物膜的院内感染细菌之一。本文采用的两种检测方法检测本院临床分离的83株大肠埃希菌生物膜的阳性检出率分别为37.3%、45.8%，无统计学差异。但我院临床分离的大肠埃希菌形成生物膜的检出率明显低于文献[8]的报道。本实验以CLSM观察结果为真阳性标准，刚果红-阿利新蓝联合染色的敏感性为81.8%、特异性为100%，半定量粘附实验的敏感性为100%、特异性为78.6%。因此，在观察生物膜形成的实验中，特别是标本量较大的实验中，可考虑利用半定量粘附实验的敏感性高、特异性相对较低的特点，对菌株是否形成生物膜进行过筛检查，可疑菌株则可用刚果红-阿利新蓝联合染色特异性高的特点加以证实。

据美国疾病预防控制中心(CDC)和美国国家卫生研究院(NIH)估计，约60%～80%的人类细菌感染性疾病的发生与生物膜有关。近年来，随着人工假体、各种导管等医疗材料的广泛应用，人口老龄化及免疫低下人群的出现，使生物膜感染在医院细菌感染中所占比例逐年上升，并且感染后果日趋严重。因此，生物膜检测方法的优化不容忽视，并且还需要大量实验广泛而深入的研究，才能得到客观、准确的检测结果，为临床生物膜的检出及对细菌生物膜耐药性的研究提供可靠的帮助。

参考文献

[1]Bräunlich M, Okstad OA, Slimestad R,etal. Effects of aronia melanocarpa constituents on biofilm formation of escherichia coli and bacillus cereus[J]. molecules,2013, 18(12): 14989-14999.

[2]谢红梅,胡必杰,周昭彦,等.铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究[J].中华医院感染学杂志,2007,17(12):1475-1477.

[3]邢铭友,刘莉娜,龚凤云,等.表皮葡萄球菌Ica操纵子与细胞间多糖粘附素及生物膜表型的相关性[J].华中科技大学报(医学版),2008,37(4):449-452.

[4]李俊娟,王强,孙开宇,等.铜绿假单胞菌生物膜与亚抑菌浓度抗菌药物的相关研究[J].中华医院感染学杂志,2012,22(24):5437-5440.

[5]林丽华,余加林,刘官信.大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及结构定量化分析[J].中国微生态学杂志,2012,24(1):22-26.

[6]Samimi DB, Bielory BP, Miller D,etal. Microbiologic trends and biofilm growth on explanted periorbital biomaterials: A 30 year review[J].Ophthal Hast Reeonstr Surg, 2013, 29(5):376-381．

[7]Abohins C, Dowsey MM, Peel T,etal. Early prosthetic hip joint infection treated with debridement, prosthesis retention and biofilm-active antibiotics: Functional outcomes, quality of life and complications [J].Intern Med J,2013,43(7):810-815.

[8]熊杰,杨继勇,邹自英,等.临床血液分离大肠埃希菌株耐药性及生物被膜形成分析[J].重庆医学,2012,41(35):3699-3701.

(收稿：2015-04-24)

【中图分类号】R446.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.046

△ 陕西中医药大学第二附属医院检验科