黄芪次生代谢研究进展＊

张开雪，刘振鹏，闫 嵩，任伟超，刘秀波，马 伟

（黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040）

黄芪次生代谢研究进展＊

张开雪，刘振鹏，闫 嵩，任伟超，刘秀波，马 伟＊＊

（黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040）

目的：黄芪为豆科植物，它的生物活性成分种类很多，且都有不同的药理作用。黄芪内生真菌的报道很少，所以对它的研究才刚刚开始。植物次生代谢网络复杂，利用诱导子提高植物特定代谢途径的次生代谢产物的产量，对生物合成途径进行调控。诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子，而关于诱导子的作用机理，只有一个初步的假说，没有作用机理的指导，筛选也较盲目。为了消除试验的背景噪音，无土栽培方式在植物内生真菌及根际微生物研究中，消除了土壤菌群的影响。随着新学科的产生和新技术的发展，组学技术、新一代测序技术应运而生，并在各个领域得到广泛应用。

黄芪 次生代谢 诱导子 无土栽培 组学技术 新一代组学技术

《中国药典》（2015版）规定，黄芪是蒙古黄 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao或 膜 荚 黄 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，而蒙古黄芪是膜荚黄芪的变种。黄芪又称戴糁、芰草、百木、黄耆，首载于中国古代第一部本草著作《神农本草经》，味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效[1-6]。其基原为豆科黄芪属Astragalus Linn.植物，多年生草本，全世界共有11个亚属2 000余种，中国有8个亚属278种[2]，广泛分布于中国华北、东北、内蒙古和西北地区，主产于黑龙江、内蒙古、山西、辽宁、河北等地，是重要的北方药材。

黄芪广泛应用于临床配方，具有强心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保护脏器等多种药理作用[7，8]。黄芪中含有多种生物活性成分，包括多糖、皂苷、黄酮、氨基酸、亚麻酸、亚油酸、谷甾醇、叶酸及多种微量元素等，其中黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮等为其特征活性成分。黄芪多糖具有免疫调节、提高巨噬细胞活性、抗肿瘤等作用[9-13]。黄芪甲苷具有抗炎、镇痛、降压、镇静等药理作用[14]。黄芪黄酮具有增强机体非特异性免疫及特异性体液免疫[15，16]、抗心肌缺血[17-22]、防护肝损伤[23]等药理作用。

1 诱导子在植物次生代谢途径研究中的应用

植物次生代谢网络复杂，使人们通过不同的方法来刺激代谢途径以增加目标次生代谢产物的合成量。目前，利用诱导子对目标次生代谢产物的生物合成途径进行调控，已被看作是一种大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法。诱导子能够对植物的特定基因进行诱导表达，开启相关的植物次生代谢途径，积累目标次生代谢产物，从而提高植物特定代谢途径的次生代谢产物产量。

1.1 诱导子的种类及应用

从植物病理学角度进行的定义，诱导子（Elicitor）是指能引起植物抗病生理过程，诱导植物产生植保素（Phytoalexin）并引起植物过敏反应（Hypersensive Reaction，HR）的因子[24]。诱导子是一类特殊的触发因子，它能够开启代谢过程中酶的活性，因而能够增加次生代谢物的含量，有时甚至可以诱导出新的化合物。诱导子根据来源可分为非生物诱导子（Abiotic Elicitor，AE）和生物诱导子（Biotic Elicitor，BE）。其中，AE以物理和化学因子引起诱导作用，BE是植物体在防御过程中为抵抗微生物感染而产生的有诱导作用的诱导子[25]。

1.1.1 非生物诱导子

非生物诱导子不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。常见的非生物诱导子有乙烯（Ethylene，ET）、水杨酸（Salicylic Acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）、茉莉酸甲酯（Jasmonic Acid Methyl Ester， MeJA）、草酸（Oxalic Acid，OA）等，还有一些金属离子和紫外光，这些因素均能诱导植物产生抗性，增强其次生代谢途径[20]。外源性MeJA类化合物能有效刺激植物萜类、黄酮类、生物碱类等次生代谢物的生物合成[26-29]。SA可诱导紫杉醇含量的提高[30]，促进胞内过氧化物含量增加[31]。用Cu2+处理能增加红豆杉培养细胞紫杉醇含量的提高[25]。紫外光能刺激胡萝卜素、类黄酮、多酚和质体醌等次生代谢产物的形成[32]。

1.1.2 生物诱导子

生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物。对于生物诱导子来说，目前应用最广、研究最多的是真菌诱导子。真菌诱导子的特点是能快速、高度专一和选择性的诱导植物特定基因的表达，从而活化相应次生代谢途径，最后产生目标次生代谢产物[33，34]。自从1968年Crutckshand等首次对真菌诱导子进行了报道后，对真菌诱导子的研究对象有很多：将灰葡萄孢、灰黄霉素、大丽轮枝孢和融黏带酶混合培养滤液作为诱导子来提高紫杉醇、紫杉碱的产量[35]，利用葡萄孢属的真菌菌丝体匀化产物作为诱导子来提高罂粟血根碱的含量[36]，利用真菌诱导子提高红豆杉细胞紫杉醇的含量[37-39]。

1.2 诱导子的作用机理及筛选

从目前的研究来看，诱导子对次生代谢途径的调控具有专一性，对同一代谢途径调控的诱导子具有多样性。例如，真菌诱导子可快速激活百脉根的毛状根中的苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine Amino Lyase，PAL）合成异黄酮化合物，而对其它无直接关系的酶没有明显的作用；也有研究者发现用12种不同真菌菌丝体匀浆对长春花细胞悬浮培养，其吲哚生物碱含量和对照组比较均明显提高[40，41]。而诱导子作用机理只有一个初步的理论假说：诱导子作为一种外界信号引起植物细胞膜上的受体位点识别，识别后两者的结合引起细胞膜上及细胞内相关的生理生化连锁反应，与植保素有关的酶活性发生改变，最终导致植保素的合成和积累。

由于没有作用机理基础理论的指导，使诱导子的筛选工作成为困扰研究者多年的一个难题，目前的筛选还停留在较盲目的尝试阶段。要想有效地利用诱导子来提高目标次生代谢产物的产量，就要对次生代谢途径的关键酶及相应的诱导子进行具体研究，弄清楚两者之间的调控关系，如此才能将“诱导子诱导-合成目标次生代谢产物”的整个链条贯穿起来。根据目标代谢产物的特征结构及其相应的生理功能选择与之相应的诱导子，从而避免目前诱导子筛选工作的盲目性。

在真菌诱导子的研究中，也应加强诱导子的纯化和结构分析，因为在研究真菌对次生代谢调控的影响时，往往使用的是多种菌体及其发酵液的混合物，在混合物中难以避免不同调控作用的诱导子之间起相互作用，这样就可能会削弱或增强某个诱导子的调控程度，使其调控作用结果复杂而不稳定，为研究工作带来困难。对真菌诱导子进行纯化，能清楚的对其结构和功能做进一步的确定，这样就能揭示真菌诱导子在植物次生代谢途径中的调控机理。将结构和功能清楚的诱导子用于次生代谢产物的生产，提高目标次生代谢产物的产量。在具有相同生物产量的植株群体中生产出更多的目标次生代谢产物，自然资源利用率会大大提高，将会大大降低目标次生代谢产物的生产成本，它将带来可观的经济、社会及生态效益。

2 黄芪内生真菌的研究现状

黄芪为豆科黄芪属多年生草本植物，和多数豆科植物一样，黄芪和土壤根际微生物菌群的共生现象非常普遍。由于黄芪属于药用植物，相关研究多集中在药理和病理方面，针对其内生真菌的研究较少，现有报道集中在近几年，内容只涉及内生菌菌种的分离、内生真菌和寄主次生代谢物质相似性研究，并未将其作为诱导子用于黄芪次生代谢途径的研究。因此，对黄芪内生真菌的研究处于起步阶段。有研究从黄芪中成功分离出内生菌，经鉴定，这些内生菌一般具有抑菌活性。例如，从膜荚黄芪Astragalus membranaceus叶中分离得到一株瓶霉菌属Phialophora sp.内生真菌，对常见的4种细菌有不同程度的抑菌活性[42]；从蒙古黄芪中分离并鉴定出7个菌属28种内生菌菌株[43-44]；从恒山黄芪（属于蒙古黄芪）中分离得到分属于3目、6科、17属的内生真菌菌株49株，其中有33株菌至少能抑制1种指示菌[45-47]。

3 无土栽培在根际微生物研究中的应用

为了消除试验的背景噪音，研究者建立了各种试验操作体系以消除不可控因素。早期研究温度及光周期等因素对植物的影响时，科研工作者使用了人工气候室进行试验；在研究基因功能过程中，科研人员利用全基因组测序遗传背景清楚的模式植物，并建立了组织培养体系以及细胞悬浮体系，这些手段都在具体研究中起作用，并得到了相应的成果。例如，利用细胞悬浮体系建立的细胞发酵工程工业化生产目标产品。基因工程研究对象都是植物的特定组织和细胞，当这部分组织和细胞离开母体系统后，整个代谢调控网络发生改变，研究结果只能适用于试验室以及对技术要求很高的生物工程的工厂化生产，无法用于大面积的野外自然条件下的生产。

在植物内生菌及根际微生物的研究中，土壤环境含有的微生物群落增加了背景噪音，选择无土栽培方式来消除土壤菌群的影响无疑是个好办法。无 土 栽 培（Soilless Culture，Hydroponics，Solution Culture）是指不用天然土壤，而用营养液或固体基质加营养液栽培作物的方法[48]。

1859-1865年期间，德国科学家萨奇斯（Sachs）和克诺普（Knop）进行植物矿质营养的生理研究，为无土栽培技术研究揭开了序幕。无土栽培先后经历了无土栽培的试验研究阶段[49,50]、生产的起步阶段[51]，真正发展阶段开始于1970 年丹麦 Groden公司开发的岩棉栽培技术和 1973 年英国温室作为研究所的 NFT 技术[52]。20 世纪 70年代以后，随着营养液膜技术和岩棉栽培技术的发展，世界上商业性的蔬菜和花卉无土栽培逐渐深入到生产中。进入 20世纪 80 年代以后，科学技术的快速发展推动了无土栽培生产的扩大，无土栽培生产亦进入了一个迅速发展阶段。

无土栽培最广泛的应用是在蔬菜栽培生产中，在过去几十年的全世界蔬菜生产过程中，因具有无公害生产的环境优势[54-56]，而越来越受欢迎[53]。蔬菜的无土栽培过程中，与传统土壤栽培条件下相似的植物根部病害依然困扰着生产者，进行营养液和栽培槽消毒虽然可以解决这个问题，但是这一方法成本很高，不但破坏了植物根系的有害微生物，也破坏了植物根系周围的有益微生物群落。最近，研究者将更多的兴趣都集中于各种微生物在无土栽培中的作用[57]。有报道显示，在无土栽培体系中利用有益微生物进行生态防治的效果好于在传统的土壤栽培环境中的有益微生物生态防治。因此，推断在无土栽培的环境系统中有益微生物的菌群比在传统土壤环境中更容易建立。

4 组学技术和新一代测序技术的应用

4.1 组学技术的应用

组学技术（Omics Technology）是随着系统生物学（Systems Biology）新学科的产生和发展应运而生的，主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术等，系统生物学及组学技术是近20年来生物学研究发展最为迅速的领域。基因组学（Genomics）是研究生物基因组的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的科学；蛋白质组学（Proteomics）是指对“一种基因组所表达的全套蛋白质”，包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质进行研究的科学；代谢组学（Metabolomics）则是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。

转录组（Transcriptome）的概念由 Velculescu VE.等首先提出。转录组是指特定细胞在某一功能状态下全部表达的基因总和，代表了每一个基因的身份和表达水平。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，基因表达情况是不完全相同的，具有特定的空间性和时间性特征[58]。与基因组具有静态实体的特点不同，转录组是受外源和内源因子调控的。因此，它是物种基因组和外部物理特征的动态联系，是反映生物个体在特定器官、组织或某一特定发育、生理阶段细胞中所有基因表达水平的数据。可用来比较不同组织或生理状况下基因表达水平差异，发现与特定生理功能相关的基因，推测未知基因。

由于组学技术能够一次从整体上观察分析得到大量的指标变化，已经成为基因功能和生物标志物的研究中的主要研究手段。不同组学技术之间的交叉使用和数据关联、组学技术和传统的分子生物学手段有机结合都将是未来转化各领域研究的重要手段。

4.2 转录组学技术在药用植物次生代谢研究中的应用

药用植物和药用植物提取物及其衍生物是临床用药的主要来源。以提高药用植物次生代谢产物，而对药用植物次生代谢网络及其调控的研究，一直是药用植物应用领域的研究中心。采用单个基因点的研究方式，无法全面阐述次生代谢途径和构建代谢调控网络[59，60]。各种组学的研究为药用植物次生代谢调控网络的研究提供了可能，其中转录组学从基因转录水平反映了基因的表达情况，为药用植物次生代谢途径中关键基因的筛选和功能的研究提供了技术支持。

如今，转录组学研究已经在药用植物中得到了广泛的应用，已经成为发现新基因与关键基因克隆及功能验证的重要手段之一。在西洋参中利用转录组学技术挖掘出24条可能参与人参皂苷生物合成相关酶的基因，通过功能验证鉴定出了甲羟戊酸（Mevalonic Acid，MVA）代谢途径中的关键酶——3-甲基-3-羟基戊二酰辅酶A还原酶（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGR）基因，明确了西洋参中人参皂苷的生物合成途径[61-62]。由于药用植物没有基因组测序背景作参考，采用测序长度较长的454/Roche GS FLX测序技术，对于基因的拼接结果更为可靠，利用该技术对西洋参的根进行了高通量转录组测序，发现了可能参与不同类型人参皂苷生物合成过程相关的150条细胞色素P450和235条糖基转移酶候选序列[63]；同样使用该技术对丹参的2年生根部进行转录组高通量测序，获得1.8万余个unigene。通过unigene注释和功能分类，其中27个unigene可能参来自于参酮合成的代谢途径，29个unigene可能来自于丹酚酸合成的代谢途径，70个unigene可能来自于CYP450过程，还有转录因子序列577条[64]；对乌拉尔甘草的454/ Roche GS FLX高通量转录组测序，共获得2.7万多个unigene，发现了属于甘草甜素生物合成途径中的16个酶的基因，从而初步建立了甘草甜素生物合成途径[65]。利用分子生物学技术实现药用植物次生代谢途径中关键酶基因的克隆与体外高效表达，进行次生代谢生物工程化生产，大规模的生产药用植物的生物活性成分是未来发展方向。

4.3 新一代测序技术在组学中的应用

随着生命科学进入后基因组时代，功能基因组学、转录组学、蛋白质组学、系统基因组学等组学研究越来越引起人们的重视，相应的对测序技术要求也越来越高，传统测序方法在测序深度和广度等方面已经无法满足大规模基因组测序的需求。研究者已经到认识到快速、低成本测序技术对生命科学发展的重要性。在此背景下新一代高通量测序（Next-Generation Genome Sequencing,NGS）技术应运而生，其中最具代表性的技术平台有454/Roche GS FLX、Illumina基因组分析仪Ⅱ系统及应用系统生物公司的SOLiD测序技术。

NGS技术具有速度快、成本低、测序度深、产出量大等特点，使其在生命科学研究领域迅速得到广泛应用。在植物分子生物学研究领域，NGS技术的出现使基因组测序、转录组测序、lncRNA测序、microRNAs 测序等不再是难题，有力地支持和推动了植物分子生物学的研究。同时，NGS技术在非模式植物全基因组测序工作中也起到了极大的推动作用，新物种全基因组测序的信息不断被公布，使科研工作者摆脱了对非模式植物研究缺乏遗传背景的束缚。2002年的植物全基因组测序完成量是3例，2010年的植物全基因组测序完成量是32例，仅在2010年就有苹果、黄瓜和玉米的大型基因组得以测序完成[66-68]，相隔8年，完成量增加了9倍多，平均一年有4个植物的基因组被测序完成。2011年，可可、橡胶树、野草莓、麻风树等多种植物基因组测序完成[69-72]。

转录水平的调控是生物体最主要的调控方式之一，对转录水平的研究已从基因芯片技术步移到建立于高通量测序基础上的转录组研究。对同一样品的深度测序即使是低表达量的基因也可以被捕捉到，而对不同样品进行同时测序可以获得样品之间的差异表达基因。对有参考基因组的转录组进行研究还可以获得转录本的表达丰度，转录发生位点，可变剪切，转录本SNP等重要生物学信息[73]。如对红花种子、叶片和花使用Illumina的Solexa测序技术进行转录组测序和数据的生物信息学分析，获得了红花这3个部位的差异表达基因[74]。

转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。早期研究认为非编码RNA（ncRNA）是没有功能的基因，只有少数的ncRNA分子可作为生物遗传信息从DNA传向蛋白质过程中的中间过渡产物，其功能是协助RNA转录与蛋白质翻译[75]。近年来，随着相关技术的发展进步，研究发现基因组中约有50%的DNA转录为RNA，仅有约2%的RNA参与蛋白质的翻译，剩余的98%均不参与[76]。ncRNA 按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者通常稳定表达，发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能，主要包括转移 RNA（tRNA）、核糖体 RNA（rRNA）、小核RNA（snRNA）及小核仁 RNA（snoRNA）等；后者主要包括长链ncRNA（lncRNA）和以microRNA为代表的小ncRNA（small ncRNA），在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达[77]。

过去几年里对ncRNA的研究大部分集中于小ncRNA[78，79]。有研究者对草莓不同发育时期果实的microRNA进行Illumina的Sloexa深度测序。基于microRNA 相似性序列和二级结构预测，从测序数据中获得164个保守的microRNA和37个新的microRNA。通过RT-PCR技术对37个新的microRNA进行验证，来进一步预测新的microRNA的潜在靶基因，对其进行功能注释分析发现，这些microRNA可能编码SNARE蛋白、PLAC8家族蛋白、RNA结合蛋白、NAC转录因子等功能蛋白。这些microRNA具有较高的测序频次，表明它们在草莓的果实中有很高的表达量，这说明它们参与了草莓果实的生长发育[80]。lncRNA 由于序列保守性较低曾经一度被认为是转录噪音，随着研究的不断深入直到近几年才证明，lncRNA 具有明确的生物学功能[81，82]。目前对 lncRNA 的认识尚处于初级阶段，一般认为大于200 nt且缺乏蛋白编码能力的转录本为lncRNA，迄今发现的lncRNA长度从几百nt到十几nt不等，大概可以分为正义的、反义的、内含子型的及基因间的[83]。lncRNA可以通过不同模式发挥多种分子功能，如调节转录模式，调节蛋白质活力，具有结构和组织功能，改变RNA加工方式和作为一些小RNA的前体[84]。

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Research Progress on the Secondary Metabolism in Astragalus

Zhang Kaixue,Liu Zhenpeng,Yan Song,Ren Weichao,Liu Xiubo,Ma Wei
(College of Pharmaceutical Sciences,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Belonging to leguminous plants,Astragalus contained a variety of biological active ingredients with different pharmacological effects. However,endophytic fungi of astragalus were seldom reported,it was a preliminary research in this study. The plant secondary metabolism network was complex,referring to using specific metabolic pathways of plant secondary metabolites production to improve yield through elicitors,and regulation of biosynthetic pathways. Elicitor included biological elicitor and abiotic inducer. So far,there has only been a preliminary hypothesis over the mechanism of the inducer,lacking of related guidances. The process of screening was slapdash. For eliminating the ambient noise in the test,soilless cultivation in the research of endophytic fungi and rhizosphere microorganisms was utilized,all at once,to eliminate the impact of soil bacteria.With the emergence of new courses and technologies,omics technologies and updating sequencing technology were produced and widely applied in various fields.

Astragalus,secondary metabolism,elicitor,soilless cultivation,omics technologies,updating omics technology

10.11842/wst.2016.05.025

R282.2

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-11-06

修回日期：2016-11-16

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81274010）：黄芪三萜皂苷类生物合成分子机制调控的研究，负责人：马伟；黑龙江省科技厅杰出青年基金项目（JC201101）：黄芪SQS基因的克隆、亚细胞定位和功能研究，负责人：马伟；黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”（2012001）：黄芪SQS基因的克隆、亚细胞定位和功能研究，负责人：马伟；哈尔滨市科技厅优秀学科带头人基金项目（2014RFXXJ122）：诱导调控黄芪次生代谢有效成分途径及转录组学研究，负责人：马伟。

＊＊ 通讯作者：马伟，研究员，主要研究方向：药用植物生物工程。