中药有效性评价与药效物质基础发现＊

张爱华，孙 晖，闫广利，王喜军

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

中药有效性评价与药效物质基础发现＊

张爱华，孙 晖，闫广利，王喜军＊＊

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

中药有效性是中医药治疗优势的根本体现，而有效性的科学阐释是沟通中医学与现代医学科学的渠道，中药有效性评价是发现药效物质基础的前提。因此急需建立一种生物学语言，把中药的有效性科学地表达出来，让现代生命科学领域认识和接受中医理论及临床实践的科学价值。证候和方剂是中医学的两个关键科学问题，直接关系到疾病的诊断和临床疗效的有效性。由此，本课题组以证候生物标记物发现为切入点，以方剂为研究对象，建立阐释中药有效性的理论及研究方法——中医方证代谢组学（Chinmedomics），为中药有效性评价提供了有效途径。利用中医方证代谢组学研究方法，揭示临床常见中医证候的生物标记物及其相关方剂的有效性，推动了证候的精准诊断及临床治疗经验的挖掘，为提升中医理论及临床实践的科学价值的认识提供了科学依据。

中医方证代谢组学 中药血清药物化学 有效性评价 药效物质基础 生物标记物

健康模式及疾病谱的变化给现代医学研究提出众多新的命题，单靶点单一药物的简单治疗模式难以解决多靶点复杂性疾病的治疗问题，个体化的精准诊断及治疗又对现代医学提出了新的挑战。中医学方剂配伍的协同增效联合干预措施，以及中医学辨证论治个体化治疗的精准潜力等在解决多靶点复杂性疾病治疗问题方面积累了大量有价值的临床经验，具有鲜明的特色和优势[1-3]。而中药的有效性是中医治疗优势的根本体现，也是横在中医学与现代医学科学家之间难以逾越的鸿沟，致使中医学的优势及其临床经验的价值难以被充分接受及发挥更有效的作用。如何建立一种能够科学阐释中药有效性及其机制的生物学语言，是建立起中医学与现代医学科学沟通的桥梁，是发挥中医药在治疗复杂性疾病及个体化精准治疗方面优势的前提。

中药有效性评价是挖掘和揭示中医药治疗优势的前提，而有效性是与证候和方剂两大中医学关键科学问题直接相关的[4]。然而，中医证侯的模糊性及方剂的复杂性极大地限制了方剂的有效性评价及药效物质基础的确认；现行有效性评价方法难以体现中医药治疗复杂性疾病的多成分、多环节、多靶点的整合作用特点[5]。由此，揭示证侯生物标记物，建立方剂的药效生物评价体系，是评价中药的有效性及发现中药药效物质基础的必然要求[6]，也是目前国际关注的热点问题。基于上述思考，90年代初本课题组开始进行了一系列相关的理论及方法研究。并率先提出了从口服方剂后的含药血清中分离鉴定中药药效物质基础的思路和研究设计，建立了中药血清药物化学的理论及方法体系，为发现中药药效物质基础，解决中药有效性及安全性等质量问题提供了方法学支撑[7，8]。然而，限于当时的技术水平，中医证候生物标记物尚未被有效阐释，方剂的疗效评价体系未能建立，只是单纯分析体内成分及其动态，没能实现将体内成分和临床有效性相联系，研究设计存在超越了证候的致命性缺点。因此必须将研究方法与临床疗效评价紧密结合才能发现表达方剂治疗效应的物质基础。正是由于证候缺乏客观的诊断标准，从而方剂疗效难以正确评价，导致血清药物化学所揭示的方剂体内成分与临床疗效关系难以有效揭示，成为制约中药血清药物化学方法有效实践的关键问题。对此，本世纪初本课题组将代谢组学技术引入中医药研究[9]，并将研究工作与中医临床研究相结合，在中医证候临床体征要素研究的基础上，将中药血清药物化学与代谢组学有机整合，利用代谢组学技术揭示证候的生物标记物，利用血清药物化学方法发现有效状态下方剂的体内直接作用物质的显效形式；在治疗有效状态下将内源性证候的生物标记物与外源性方剂显效成分相关联，挖掘与证候标记物轨迹变化高度关联的药物成分，发现并确定中药药效物质基础及有效性机制，揭示方剂配伍规律及其科学内涵[10]。由此，在大量研究实践基础上，形成了阐释中药有效性的理论及方法体系——中医方证代谢组学（Chinmedomics[11]），为中药有效性的阐明，临床证候的精准诊断及精准治疗，以及基于经方的创新药物设计提供有效的研究方法[12]，并在多个证候及相关方剂的研究中得以完善，并开展了大量的研究实践[13]，在解决中药有效性等科学问题方面取得了系列的创新性成果。

本课题组采用中医方证代谢组学方法表征了心气虚证的代谢轮廓及相关生物标记物，揭示了温心方治疗心气虚证的有效性及其药效物质基础[14]。鉴定了心气虚证17个代谢生物标记物，主要包括3-氧代十六烷酸、7-酮去氧胆酸、3b，7b，12a-三羟基-5b-胆酸、甘油酸1，3-二磷酸、左旋肉碱、尿酸、二十四碳一烯酸、十八酸、羟基犬尿氨酸等，主要涉及脂肪酸代谢、胆汁酸代谢、嘌呤代谢、色氨酸代谢途径。给予温心方治疗后代谢生物标记物的轨迹变化产生明显回调趋势。研究表明，温心方通过改善脂肪酸代谢、胆汁酸代谢、嘌呤代谢、色氨酸代谢等多个代谢通路，反向调节心气虚证的生物标记物使代谢轮廓整体回调。后来，本课题组又表征了温心方治疗心气虚证显效状态下的32个血中移行成分[15]，主要包括人参皂苷类、芍药苷类、没食子酰基葡萄糖类、原小檗型生物碱类、酚酸及酚苷和不饱和脂肪酸类等原型成分及原小檗型生物碱类去甲基和亚甲基及其葡萄糖醛酸结合产物等代谢产物。通过方剂体内显效成分与证候生物标记物关联度方法，分析与生物标记物轨迹变化高度关联的体内直接作用物质。研究表明，芍药苷、人参皂苷Rg1、芍药内酯苷、小檗碱、巴马亭、表小檗碱为温心方治疗心气虚证的关键药效物质基础。

本课题组利用中医方证代谢组学技术评价开心散防治老年痴呆症（Alzheimer’s Disease，AD）的整体效应及并鉴定了AD相关的生物标记物及代谢途径[16]。聚焦发现了与AD发生发展相关的49个血液代谢生物标记物，主要包括环氧二乙糖、丙氨酸、乙基葡糖苷酸、异冬谷酸、4-咪唑啉酮-5-丙酸、碳酰乙醇酰胺胆酸、9（s）-十八碳二烯酸、甘油磷脂酰胆碱等，涉及色氨酸代谢、酪氨酸代谢、脂肪酸代谢等代谢途径。利用中药血清药物化学方法表征了开心散治疗AD显效状态下的血中移行成分，主要包括人参皂苷（Ra1、Ra2、Rb2）、茯苓新酸、远志讪酮Ⅲ、西伯利亚远志咕吨酮、远志苷类等46个原型成分及1，6，7-三羟基-2，3-二甲氧基讪酮、6，8-二羟基-1，2，3-三甲氧基讪酮、远志讪酮Ⅱ等20个代谢产物。通过体内显效成分与代谢生物标记物关联度分析方法确定与生物标记物轨迹变化高度关联的体内化学成分，包括人参皂苷 （Ra1、Ra2、Rb1、Rd、Re、Rb2）、去氢土莫酸、土莫酸、16-脱氧茯苓新酸B、25-甲氧基茯苓新酸、三七皂苷R1、丙二酰基人参皂苷Rb1、丙二酰基人参皂苷Rc、乙酸苯酯等原型成分，以及E-3，4，5-三甲氧基肉桂酸“去乙基”、“葡萄糖醛酸化”、“去乙基+葡萄糖醛酸化”的代谢产物，远志苷 D “去乙基+葡萄糖醛酸化”、1，6，7-三羟基-2，3-二甲氧基讪酮“葡萄糖醛酸化”，远志讪酮Ⅰ“葡萄糖醛酸化”、“去乙基+葡萄糖醛酸化”，茯苓新酸E、茯苓新酸C “去乙基”，土莫酸“去乙基+葡萄糖醛酸化”，远志讪酮Ⅱ经“去乙基+葡萄糖醛酸化”等代谢产物，为开心散治疗AD的药效物质基础。

基于中医方证代谢组学方法聚焦发现与伤寒伤阴、肝脾不和证相关的原发性痛经发生发展相关的22个尿液生物标记物，包括肌酸酐、N-乙酰-L-丙氨酸、亮氨酸-羟基脯氨酸、尿酸、N-乳酰乙醇胺、4，6-二羟基喹啉、4，8-二羟基喹啉、泛醌-1、d-脱硫生物素、D-精氨酸、异戊酰基葡萄糖苷酸、黄嘌呤核苷酸、丁基嘧啶磷、异戊氨酰 -缬氨酸、磷酰胆碱、17-羟孕酮、鞘氨醇、雌激素葡萄糖苷酸、前列腺素 A1、18-羟基皮质酮、前列腺素E2 甲酯、L-尿胆素；主要涉及淀粉和蔗糖代谢、甾类激素的生物合成、嘌呤代谢、花生四烯酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、磷酸戊糖代谢、鞘脂类代谢、色氨酸代谢等代谢途径。在治疗有效性基础上，表征了芍药甘草汤治疗原发性痛经的血中移行成分[17]，其中包括13个原型成分，主要是没食子酸、白芍苷、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、苯甲酸芍药苷、异甘草素、芒柄花黄素、甘草酸、甘草异黄酮、甘草香豆素、异甘草黄酮醇、甘草利酮，以及2个代谢产物（甘草素-4-O-葡糖苷酸、芒柄花黄素葡糖甘酸）。利用体内显效成分与生物标记物关联度方法发现芍药甘草汤的主要药效物质基础是没食子酸、白芍苷、苯甲酸芍药苷及甘草酸，其通过调节肌酸酐、N-乙酰-L-丙氨酸、亮氨酸-羟基脯氨酸、尿酸、N-乳酰乙醇胺、4，6-二羟基喹啉等关键代谢标记物，影响谷氨酰胺合成酶、磷脂酶A2、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶，通过解决花生四烯酸代谢、磷酸戊糖代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢障碍，改善原发性痛经。

基于中医方证代谢组学技术平台发现与肾阴虚火旺型前列腺炎症相关的18个血液代谢生物标记物[18]，主要包括牛磺酸、酪胺葡萄糖醛酸、尿酸、2-羟基马尿酸、抗坏血酸维生素C、L-高苯丙氨酸、马尿酸、甘氨酸等代谢标记物，涉及酪氨酸代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸、甘氨酸丝氨酸及苏氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯等代谢途径。鉴定了知柏地黄丸治疗肾阴虚火旺型前列腺炎症显效状态下的51个血中移行成分，主要包括小檗碱、巴马汀、黄柏酮、黄柏内酯、银杏黄酮、莫诺苷、马钱苷等35个原型成分及黄柏碱葡萄糖醛酸结合物、四氢巴马汀葡萄糖醛酸结合物、药根碱葡萄糖醛酸结合物等16个代谢产物。采用方剂体内显效成分与生物标记物关联度分析方法，确定了知柏地黄丸配伍环境下关黄柏治疗肾阴虚火旺型前列腺炎症显效状态下的特有药效物质基础是黄柏酮、黄柏内酯、木兰碱、巴马汀及小檗碱；发现上述成分主要通过调节尿酸、马尿酸、牛磺酸、甘氨酸等关键代谢标记物，通过解决牛磺酸代谢、苯丙氨酸代谢、嘌呤代谢、酪氨酸代谢及甘油磷脂代谢障碍，抑制了与炎症相关的氧化应激反应，进而阻止了肾阴虚火旺型前列腺炎症的发生发展。

本课题组相继通过肾阳虚证[19]、黄疸证[20]等9个中医证候代谢生物标记物及金匮肾气丸、茵陈蒿汤等14个方剂的有效性研究，使中医方证代谢组学理论和方法得到完善，形成融合了证候/病生物标记物的发现、证候相关动物模型复制、方剂体内显效成分分析及方剂体内显效成分与生物标记物关联度分析等方法与技术的中医方证代谢组学理论及研究体系，为阐释中药药效物质基础及有效性优势提供了有效途径。目前，“中医方证代谢组学”被国内外广泛接受并引用。2015年底，《Nature》（自然）（VOL528，Issue No. 7582）详细介绍该理论，认为该策略搭建了中医学与现代医学科学沟通的语言桥梁，对于深入认识中医药的有效性，提升中医临床经验的社会价值，推动中医药学术进步及新医学理论形成具有重要意义。

中医是复杂的特殊的生命科学，其辨证论治的理论不仅仅体现在个体化精准治疗，更重要的是体现在关注证候，而证候是人与病结合的表型，具有高度的复杂性；由此，中医在临床实践中一贯采取联合干预的治疗措施，采取多药物配伍组成的方剂对应复杂的证候，即方证对应。这种诊治疾病的理念和临床实践，在解决当前多基因复杂性疾病方面，以及个体化精准治疗方面均体现其特有的优势。而中医方证代谢组学即是以系统生物学语言阐释复杂性证候实质及中医方剂有效性，阐释中医药有效性优势，从根本上揭示“方剂-体内显效成分-生物标记物-证候”的对应关系实质，从而挖掘中医理论及临床实践社会价值。

然而，由于证候的复杂性及病证结合状态的普遍性，使阐释人与病结合的证候表型及病证结合表型更具有挑战性；加之，代谢组学本身也存在某些技术层面的问题，使单纯的利用代谢组学阐释其证/病的生物学本质存在一定的局限性。未来必须在代谢标记物的基础上，关注上游的功能蛋白及基因，从而使证候生物学本质研究更深入更具体，促使治疗更精准；如此，也能使方剂的有效性评价及药效物质基础的发现更具有临床价值。在中医方证代谢组学理论建立之初，本课题组已经考虑到此问题，研究实践中也在紧紧地与蛋白组学等其它组学相结合。由于代谢组学是该理论的核心技术，所以在该理论的中文名称上称为“中医方证代谢组学”，而英文名称为“Chinmedomics”[11]，是以组学“omics”进行定义的，也是考虑给该理论留出空间，在未来引入并整合蛋白组学、转录组学及基因组学等理论和技术，使该理论不断在实践中得以完善。同时，下一步将在各种临床常见证候患者大样本方证代谢组学分析，以及病证结合患者大样本方证代谢组学分析的基础上，通过大数据整合分析，建立涵盖常见中医证候及病症结合表型的代谢轮廓及生物标记物、代谢轮廓与有效方剂、生物标记物与有效成分的软件包，实现病证的精准诊断，基于标记物分析的精准治疗和药效物质基础发现方面进一步创新。

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Evaluating Effectiveness and Discovering Efficacy Substances of Traditional Chinese Medicine

Zhang Aihua,Sun Hui,Yan Guangli,Wang Xijun
(Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center,National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry,Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The effectiveness of traditional Chinese medicine (TCM) is a fundamental expression of its treatment advantage; and the scientific interpretation of the effectiveness is a communication link connecting Chinese medicine and modern medicine,while evaluating the effectiveness of TCM is a premise for discovering efficacy substances. Thus,it is an urgent need to establish a biological language which was valid enough to scientifically express the effectiveness of TCM,making the modern life science recognize and accept the scientific value of the TCM theory and its clinical practice. Syndromes and formulae (or prescription) are two critical issues of TCM and directly related to the disease diagnosis and the effectiveness of TCM clinical efficacy. For these reasons,our team has taken syndrome biomarkers as the starting point and the effective prescription as the research object,and established the “Chinmedomics strategy” to investigate the efficacy substances and mechanisms behind formulae’s protective effect on syndromes,providing an effective way for evaluating the effectiveness of TCM. Through Chinmedomic techniques,we can reveal the candidate biomarkers of the common clinical syndromes and the effectiveness of related prescriptions,which allows us to promote the accurate diagnosis of syndromes and mine the clinical experiences,and provide scientific evidences for enhancing the value of the theory and the clinical practice of TCM.

Chinmedomics,serum pharmacochemistry of TCM,effectiveness,efficacy substance,biomarkers

10.11842/wst.2016.05.001

285

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-04-10

修回日期：2016-04-10

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81430093）：中药体内药效物质基础的系统分析方法学——中医方证代谢组学研究，负责人：王喜军；国家自然科学基金委面上项目（81373930）：基于代谢标记物及代谢经路的生脉散防治老年性痴呆的药效物质基础及作用机制研究，负责人：王喜军；国家自然科学基金委青年基金项目（81302905）：基于药物代谢组学的开心散防治老年痴呆症的物质基础及机制研究，负责人：张爱华；科学技术部“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09101043-005， 2015ZX09101043-011）：中药经典名方整合作用机制关键技术研究，负责人：王喜军。

＊＊ 通讯作者：王喜军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中药血清药物化学及中医方证代谢组学研究。