基于目标链双重信号放大的电致化学发光生物传感器的研究

李朝阳，张璞，王海军，吴潇雨，卓颖，柴雅琴

（西南大学化学化工学院，发光与实时分析重点实验室，重庆 400715）

基于目标链双重信号放大的电致化学发光生物传感器的研究

李朝阳，张璞，王海军，吴潇雨，卓颖*，柴雅琴*

（西南大学化学化工学院，发光与实时分析重点实验室，重庆 400715）

以CdSe/ZnS量子点为发光物质，结合目标物循环放大和信号转换放大的双重放大策略，利用电致化学放光技术（ECL），构建了一种新型传感器用于前列腺癌细胞标志物microRNA-141（miRNA-141）的高灵敏检测。首先以发卡型DNA H1为模版DNA，目标物microRNA-141通过碱基互补配对打开发卡型DNA H1，得到带有部分裸露的DNA双链，当发卡型DNA H2存在的情况下，DNA H2与裸露的碱基杂交并将microRNA-141置换下来，从而实现目标物microRNA-141的循环，并得到大量的模版链。在DNA聚合酶的作用下，H1以H2为模版开始聚合，得到碱基互补配对的双链DNA。加入内切酶后，双链DNA上的两个特异性位点被剪切酶剪切，得到大量的Reporter DNA。通过该信号放大策略，实现了由一小部分DNA转换为大量的Reporter DNA。此时将得到的Reporter DNA滴加到修饰有DNA Capture 2的传感器界面上，通过碱基互补配对，Reporter DNA将修饰有CdSe/ZnS量子点的Capture 1捕获在电极表面，得到电致化学发光响应，在优化的实验条件下，线性范围为50 nmol/L～0.5 pmol/L，检测限为0.17 pmol/L（S/N=3）。该传感器对microRNA-141的检测具有灵敏度高、检测范围宽、制作简便、成本低的优点，并且具有良好的选择性和重现性。

电致化学发光；目标物循环策略；microRNA-141

0 引言

前列腺癌在西方国家男性高发的恶性肿瘤中,其死亡率高居癌症死亡率的第二位,仅次于肺癌,前列腺癌是目前最主要的危害欧美国家男性健康的肿瘤疾病[1]。近年来，我国前列腺癌的发病率呈现明显持续增长趋势，2008年中国男性前列腺癌发病率为11.00/10万，世界人口标化发病率为6.73/10万，年龄组发病率结果表示，70岁以上中国男性的前列腺癌居男性泌尿生殖系统肿瘤发病率第1位。1998年至2008年中国男性前列腺癌发病率年均增加比例为12.07%。上海、台湾和新加坡三个亚洲发达地区的肿瘤发病率资料显示：近20年时间，三个地区前列腺癌的发病率分别增加了3.3倍、8.5倍和4.8倍。目前新加坡和台湾的前列腺癌发病率都在15/10万以上，位列男性常见肿瘤的前6位。前列腺癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿系统恶性肿瘤[2]。

MicroRNA是一种小的非编码RNA[3]。在整个发展过程中,它可以调节细胞的早期发展,参与细胞分化和组织发展,并控制基因表达的生物功能。其异常表达能导致异常细胞分化、增殖、凋亡,与癌症的发生和发展密切相关[4]，microRNA的表达水平的测定可以为癌症的早期诊断提供重要信息[5]。据研究表明，通过检测microRNA-141的表达水平可以预测人类身体中前列腺癌细胞的数量[6-7]，故而该作品采用前列腺癌标志物microRNA-141作为目标物。

该研究以构建一种对microRNA-141具有低检出限、高灵敏度的传感器作为主要突破点。在技术方面，以电致化学发光（ECL）作为主要技术，其中CdSe/ZnS量子点作为电致化学发光信号。通过合理的设计，得到microRNA-141浓度与对应ECL信号的定量关系。为进一步提高传感器的灵敏度和可控性，作品引入国际研究热点的核酸放大技术，把实验的检测数量级降低至皮摩尔水平，通过引入由microRNA-141诱导引发的目标物循环，以及由少量DNA得到大量Reporter DNA的信号转换技术，达到了可控地放大电致化学发光信号的目的，实现对microRNA-141的高灵敏检测。

1 实验部分

1.1 实验试剂

PBS缓冲液（pH7.4）；Nt.BbvCI剪切酶（北京博迈斯科技发展有限公司）；Bst 2.0 DNA聚合酶（北京博迈斯科技发展有限公司）；氨基水溶性量子点-625（武汉珈源量子点技术开发有限责任公司）；三(2-羧乙基)膦（TCEP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaBH4、冰醋酸、NaCl（成都市新都区木兰镇工业开发区）；MgCl2、柠檬酸三钠（重庆川东化工（集团）有限公司）；1%HAuCl4·4H2O(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；巯基已烷（HT）(百灵威科技有限公司）；DNA链H1、H2、Capture 1 DNA、Capture 2 DNA（生工生物工程（上海）股份有限公司）

1.2 实验仪器

MPI-E型ECL分析系统多功能化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；CHI660D型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；WH-986静音搅拌器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 Reporter DNA的制备

2 μmol/L H1，H2各100 μL于PCR仪中95℃恒温5 min后，将其置于65℃水中随水冷却至室温，使H1,H2舒展为发夹型结构，取20 μL H1，20 μL H2加于200 μL PCR管中，同时加入一定浓度的20 μL microRNA-141混匀后于PCR仪中，在15℃下反应3 h，加入3.2 U/mL Bst聚合酶20 μL混匀后，于65℃反应60 min,而后加入20 μL 0.2 U/mL剪切酶在55℃下反应1 h，得到Reporter DNA溶液，（图1）冷却至室温后移至-20℃冰箱保存待用。

1.3.2 发光信号物质的制备

取0.0077 g EDC和0.0012 g NHS溶于1 mL重蒸馏水中，加入200 μL 2 μmol/L Capture 1，在室温下搅拌15 min，然后加入200 μL 2 μmol/L CdSe/ZnS量子点持续搅拌2 h后，蒸馏水进行两次离心洗涤后，稀释到200 μL，保存到4℃冰箱中避光待用。

图1 ECL传感器构建示意图Fig.1The operating principle of ECL sensing system

1.3.3 电极传感界面的制备

将玻碳电极依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化铝浆料抛光，随后在无水乙醇、去离子水中进行超声清洗，在裸电极检测达到要求后进行修饰。首先将玻碳电极置于1%的氯金酸溶液中，于-0.2 V恒电位下电化学沉积30 s，再滴加10 μL 1 μmol/L Capture 2溶液，于室温下孵育12 h，随后滴加10 μL HT溶液孵育50 min以封闭多余的结合位点，防止非特异性吸附。滴加10 μL Report DNA液和10 μL发光信号物溶液，室温下在电极表面避光孵育2 h后，即得到ECL传感器界面。

2 结果与讨论

2.1 循环伏安法表征

循环伏安法（CV）作为一种敏感的电化学技术，适用于研究电极表面发生复杂反应时电极界面的电化学行为的变化情况，被广泛用于电极界面修饰层的表征。从（图2）中可以看出，与裸电极（曲线a）相比金纳米粒子修饰过的玻碳电极氧化还原峰电流升高(曲线b)，这是因为金纳米粒子可以促进电子传递。当Capture 2 DNA组装到电极上时，由于DNA不导电而阻碍电子转移，导致氧化还原电流值降低（曲线c）。当非电活性的HT用来封闭非特异性位点后，氧化还原电流值进一步降低（曲线d）。在电极上滴加Reporter DNA、Capture 1信号物质溶液后，由于发生了碱基互补配对反应，电极表面电子转移被阻碍，氧化还原电流降低（曲线e）。

图2 电极制备过程的循环伏安表征图Fig.2CVs of the stepwise modifed electrodes performed in 0.1 mol/L PBS(pH7.4)containing 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-with the scan range of-0.2 to 0.6 V(100 mV/s).(a)bare GCE,(b)GCE/AuNPs,(c)GCE/AuNPs/Capture 2,(d) GCE/AuNPs/Capture 2/HT,(e)GCE/AuNPs/Capture 2 /HT/Capture 1 compound and Reporter DNA

2.2 MicroRNA生物传感器的响应性能

在最优条件下，将传感器用于不同浓度的microRNA-141检测，探究ECL强度与microRNA-141浓度的关系（图3)。在一定范围内，随着microRNA-141浓度的增加，ECL峰值逐渐增高，峰型良好，且ECL强度与microRNA-141浓度的半对数呈现良好的线性关系（图3）。其线性范围为50 nmol/L～0.5 pmol/L，线性回归方程为I=10392.63+3028.02 lg c,相关系数r2为0.9962，检出限为0.17 pmol/L(S/N=3)。

2.3 MicroRNA生物传感器的选择性

为了考察microRNA生物传感器的特异性，选取microRNA-21干扰物质进行测定（图4）。在核酸放大技术的应用时，分别以(A)blank，(B) microRNA-21，(C)microRNA-141，(D)microRNA-21+microRNA-141替换引发物microRNA-141，在相同条件下测得ECL信号。实验结果表明，microRNA-21对ECL信号的影响可忽略不计，即构建的传感器对microRNA-141的检测具有良好的特异性。

图3 生物传感器的矫正曲线Fig.3Calibration curve for the various concentrations of microRNA-141

图4 MicroRNA生物传感器的特异性Fig.4The specificity of the proposed ECL biosensor：(A) Blank,(B)MicroRNA-21(50 nmol/L),(C)MicroRNA-141 (1 nmol/L),(D)MmicroRNA-141(1 nmol/L)+MicroRNA-21 (50 nmol/L)

2.4 MicroRNA生物传感器的稳定性

在最优条件下，将已制备好的传感器连续扫描14圈(图5)，得到的ECL信号的相对标准偏差（RSD）为1.05%，表明传感器的稳定性良好，能保证测量的精确度，有望用于实际样品的检测。

2.5 MicroRNA生物传感器的重现性

在同一批电极中，取三根电极构建相同的传感器并测量其ECL信号，对比信号值得到批内重现性。再取同一根电极，连续三天构建相同的传感器，并测定其ECL信号，对比信号值得到批间重现性。实验结果得到批内、批间的相对标准偏差（RSD）均小于5%，说明构建的传感器重现性良好。

图5 MicroRNA生物传感器的稳定性Fig.5The stability of the biosensor with ECL intensitytime curve in the optimal conditions under consecutive cyclic potential scans for 14 circles

3 结论

综上所述，该研究将分子生物学和纳米材料技术结合，运用了目标链循环放大和信号转换放大的双重放大策略实现前列腺癌细胞内microRNA-141的高灵敏检测。该作品成功实现了microRNA-141在前列腺癌细胞内的检测、有望用于前列腺癌的早期诊断及治疗。具有灵敏度高、检测范围宽、制作简便、成本低，并且具有良好的选择性和重现性。

[1]Gupta S,Srivastava M,Ahmad N,et al.Over-expression of cyclooxygenase-2 in human prostate adenocarcinoma. [J].The Prostate,2000,42(1):73-78.

[2]Xu B,Feng N,Li P,et al.A functional polymorphism in Pre‐miR‐146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR-146a expression in vivo[J].The Prostate,2010,70(5):467-472.

[3]Guo Y,Yao W,Xie Y,et al.Logic gates based on G-quadruplexes:principles and sensor applications[J]. Mikrochimica Acta,2015,183(1):21-34.

[4]Zhang P,Wu X,Chai Y,et al.An electrochemiluminescent microRNAbiosensorbasedonhybridizationchain reaction coupled with hemin as the signal enhancer[J]. Analyst,2014,139(11):2748-2753.

[5]Chen A,Ma S,Zhuo Y,et al.In Situ ElectrochemicalGeneration of Electrochemiluminescent Silver Naonoclusters on Target-Cycling Synchronized Rolling Circle Amplification Platform for MicroRNA Detection[J]. Analytical Chemistry,2016,88(6):3203-3210.

[6]Yang C,Dou B,Shi K,et al.Multiplexed and amplified electronic sensor for the detection of microRNAs from cancer cells[J].AnalyticalChemistry,2014,86(23): 11913-11918.

[7]Zhou W,Li D,Chai Y,et al.RNA responsive and catalytic self-assembly of DNA nanostructures for highly sensitive fluorescence detection of microRNA from cancer cells[J].Chemical Communications,2015,51(92): 16494-16497.

A novel electrochemiluminescence biosensor based on the dual signal amplification

Li Zhao-yang,Zhang Pu,Wang Hai-jun,Wu Xiao-yu,Zhuo Ying*,Chai Ya-qin*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

A novel electrochemiluminescence(ECL)biosensor was constructed for the highly-sensitive detection of biomarker of prostate cancer microRNA-141 combined with the target recycling amplification and signal conversion amplification.First,microRNA-141 opened the hairpin DNA H1 by complementary base-pairing and the double stranded DNA with some exposed bases were obtained.In the presence of hairpin DNA H2,the above doubles tranded DNA would hybridized with DNA H2 to replace the microRNA and realize the recycling of target microRNA, achiving a lot of template strands.With the aid of DNA polymerase,H2 began to polymerize with H1 as the template, obtaining hybridized double stranded DNA.After the addition of nicking endonuclease Nt.BbvCI,the two specific cleavage site of DNA was nicked and the amount of Reporter DNA could be achived.With the signal conversion strategy,a small number of DNA could be successfully change into a large number of Reporter DNA.Then,the obtained Reporter DNA was incubated on the electrode surface which immobilized with DNA Capture 2 in advance to capture the CdSe/ZnS quantum dots labeled DNA Capture 1 through the complementary base-pairing.With the dual amplification strategy,the proposed biosensor realized high sensitive detection of the microRNA-141 in prostate cancer cell.The linearity range was 50 nmol/L～0.5 pmol/L with a detection limit down to 0.17 pmol/L(S/N=3). This work possess several advantages,such as simpler operation,higher sensitivity and controllable reaction,etc.

electrochemiluminescence；the doubled signal amplification strategy；microRNA-141

国家自然科学面上基金项目（21575116,21675129,21675130）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（XDJK2015A002）

*通信联系人,E-mail:yingzhuo@swu.edu.cn;yqchai@swu.edu.cn.Tel.:Fax:023-68253172