正交试验优选二岩虎果汤的水提醇沉工艺

罗忠圣， 钱志瑶， 周 镁， 黄秀平， 桂珊珊， 覃容贵*

（1.贵州康琦药械有限公司，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004）



正交试验优选二岩虎果汤的水提醇沉工艺

罗忠圣1， 钱志瑶2， 周 镁2， 黄秀平2， 桂珊珊2， 覃容贵2*

（1.贵州康琦药械有限公司，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004）

摘要：目的 优选二岩虎果汤的水提醇沉工艺。方法 以石吊兰素含有量和浸膏得率的综合评分为指标，采用正交试验考察加水量、提取次数、提取时间对水提工艺的影响，再考察药液浓缩比例、乙醇沉降体积分数、静置时间对醇沉工艺的影响。然后，进行水提醇沉工艺及药效学验证。结果 最佳提取工艺是加10倍量水，提取1次，每次1 h；最佳醇沉工艺是提取液减压浓缩至药材量与药液的体积比为2∶1，加入乙醇量为75％，静置12 h后除去沉淀。结论 该工艺所得产品与二岩虎果汤水提液的止咳抗炎作用无差异，而且稳定可行，不影响药效，可为其规范化生产提供参考。

关键词：二岩虎果汤；水提醇沉工艺；石吊兰素；浸膏得率；正交试验；止咳抗炎作用

二岩虎果汤复方的单味药均为苗药，由君药岩豇豆、臣药岩白菜、佐药虎杖、使药果上叶组成，为贵州医科大学附属医院名老中医饶天培经验方，四味药配伍合用时性凉，具有辛良解表、宣肺、补虚、化痰止咳、清血热、解毒、养阴清肺等功效，可止咳、祛痰、平喘、抗炎，临床主要用于治疗大叶性肺炎、急性支气管炎、小儿哮喘等，未见不良反应。为了将传统的二岩虎果汤水煎剂开发为现代中药制剂，本实验采用正交试验法对其水提醇沉工艺进行研究，结果报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agi1ent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；R308旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；HZT-A500、AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；98-1-C数字控温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；AS系列超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 材料 石吊兰素对照品（中国食品药品检定研究院，批号111555-200602，20 mg）。甲醇为色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司）；水为色谱纯（自制）；其他试剂为分析纯。岩豇豆、岩白菜、虎杖、岩果药材均购自贵州省贵阳市万东桥中药材市场，经贵阳医学院药学院覃容贵教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 石吊兰素的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取石吊兰素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含50 μg石吊兰素的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 按照处方比例称取药材适量，水提或水提醇沉后，将提取液置于旋转蒸发仪中浓缩成流浸膏，水浴蒸干，105℃恒温干燥箱中干燥3 h，制成浸膏。再精密称取浸膏粉末0.5 g，研细，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声（240 W、40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，75％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例（不含岩豇豆）称取药材适量，按“2.1.2”项下方法制成阴性对照品溶液。

2.1.4 色谱条件与系统适应性实验 采用Diamonsi1（R）钻石C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），包括VWD检测器；流动相为甲醇-水（50∶50）；检测波长330 nm；体积流量1 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL。理论塔板数按石吊兰素峰计算，应不小于3 000。

在选定色谱条件下，取对照品、供试品、阴性对照品溶液各10 μL分别进样。结果，测得石吊兰素对照品的保留时间约为69.9 min；供试品色谱中石吊兰素峰与杂峰的分离效果良好，分离度大于2.0；理论塔板数按石吊兰素峰计算，应不小于3 000；阴性对照色谱在相应位置上，无干扰峰产生，具体见图1。

图1　二岩虎果汤的HPLC色谱图

2.1.5 线性关系考察 精密移取标准品母液（50 μg/mL）1、2、3、4、5 mL，加甲醇稀释至10 mL，摇匀，微孔滤膜过滤，在“2.1.4”项色谱条件下测定石吊兰素峰的峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（y），石吊兰素质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程y=29.324x-6.1，r=0.999 7，表明石吊兰素对照品在5～25 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积。结果，其RSD为0.38％，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同批浸膏粉末0.5 g，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪测定，计算石吊兰素的含有量。结果，浸膏中石吊兰素的平均含有量为15.85 μg/mL，RSD 为0.66％，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 分别于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取供试品溶液（16.0 μg/mL）10 μL，注入液相色谱仪，记录石吊兰素的峰面积。结果，其RSD为1.12％，表明石吊兰素溶液在24 h内稳定。

2.1.9 加样回收试验 精密称取同一批样品9份，每份0.25 g（含石吊兰素1.42 mg/g），分为3组，分别精密加入质量浓度为60、70、80 μg/mL的石吊兰素对照品溶液5 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果，平均回收率为99.72％，RSD为1.12％（n =9）。

2.1.10 样品的测定 精密称取正交试验所得的浸膏样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。每份样品测定两次，按回归方程计算，以平均值为测定值，计算样品中石吊兰素的含有量。

2.2 正交试验优化水提醇沉工艺

2.2.1 水提工艺设计［1-2］以加水量、提取次数、提取时间为考察因素，以石吊兰素含有量和浸膏得率为考察指标，选用L9（34）正交表进行试验设计，因素水平见表1。

表1　正交试验因素水平

2.2.2 水提工艺正交试验结果及统计分析 以表2中的L9（34）设计表进行9组试验，以石吊兰素含有量和浸膏得率为指标，同时以两者的最大值为参照进行数据归一，得出权重系数。将石吊兰素含有量的权重系数设为0.7，由于原二岩虎果汤方中有效成分不明确，通常以浸出物得率为指标，因此将其权重系数设定为0.3，进行统计分析。水提正交试验结果及直观分析结果见表2，方差分析结果见表3。综合评分M=0.7X×100/2.256 +0.3Y×100/26.307。

表2　水提工艺正交试验结果

表3　水提工艺正交试验方差分析

从直观分析中的极差大小来看，其影响因素顺序为提取时间（C）＞加水量（A）＞提取次数（B）。比较各因素不同水平综合评分的均值发现，对于因素C，其优劣次序为3＞2＞1；对于因素A，其优劣次序为3＞2＞1；对于因素B，其优劣次序为1＞2＞3。

从方差分析结果来看，由于F0.05（2，2）=19，提取时间（C）、加水量（A）和提取时间（B）均无统计学意义，可能是由于石吊兰素为醇溶性物质，在水溶液中的溶解度较低所致。综合考虑，确定最优提取方案为A3B1C3，即加水量12倍，提取1次，每次2 h。

2.2.3 醇沉工艺设计［3-5］以醇沉浓度、药液浓缩比例和静置时间为考察因素，以石吊兰素含有量、浸膏得率为考察指标，采用L9（34）正交试验对醇沉工艺进行优选，因素水平见表4。

表4　醇沉工艺正交试验因素水平

2.2.4 醇沉工艺正交试验结果及统计分析 将石吊兰素的权重系数设为0.7，浸膏得率的权重系数设为0.3，进行统计分析。醇沉正交试验结果及直观分析结果见表5，方差分析结果见表6。综合评分M=0.7X×100/2.478 +0.3Y× 100/24.217。

表5　醇沉工艺正交试验结果

表6　醇沉工艺正交试验方差分析

从直观分析中的极差大小来看，其影响因素顺序为醇沉浓度（B）＞药液浓缩比例（A）＞静置时间（C）。比较各个因素不同水平综合评分的均值发现，对于因素B，其优劣次序为2＞3＞1；对于因素A，其优劣次序为3＞2＞1；对于因素C，其优劣次序为2＞3＞1。

从方差分析来看，由于F（1，2）=19，醇沉浓度（B）相对于药液浓缩比例（A）和静置时间（C）有统计学意义。综合考虑，因A（药液浓缩比例）、C（静置时间）对结果无显著性影响，而且各水平相近，故考虑实际情况，确定最优提取方法为A3B2C1，即提取液浓缩至药材量与药液的体积比为2∶1，醇沉浓度为75％，静置12 h。

2.2.5 水提醇沉工艺验证 按处方比例，称取1/10处方量药材3份，即岩豇豆、岩白菜、虎杖、果上叶各3 g，剪碎混合，按优选的水提醇沉工艺进行3次验证试验，即加12倍量水，提取1次，每次2 h，提取液减压浓缩至药材量与药液的体积比为2∶1，加入乙醇量75％，静置12 h。浓缩后，置于105℃恒温干燥箱中干燥3 h，再置于干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算浸膏得率，测定其中石吊兰素的含有量，结果见表7。由表可知，按最佳水提醇沉方案试验，浸膏得率可控制在21％左右，石吊兰素含有量大于2.2 mg/g，表明优选的工艺稳定可行。

表7　验证实验结果

2.3 水提醇沉工艺的药效学验证

2.3.1 样品的制备

原水提组：取岩豇豆、岩白菜、虎杖、果上叶各30 g，加10倍量水加热煎煮2次，每次2 h，滤过，合并滤液并浓缩，即每1 mL浓缩液相当于药材量1 g，备用。

水提醇沉组：取岩豇豆、岩白菜、虎杖、果上叶各30 g，按水提醇沉工艺优选条件制备样品，滤液浓缩，回收乙醇，即每1 mL浓缩液相当于药材量1 g，备用。

2.3.2 药效学考察 止咳试验［6-8］：取小鼠30只，分为模型对照组、原水提组、水提醇沉组，每组10只，按20 mL/kg剂量分别灌胃给药，其中模型对照组给予同体积蒸馏水，每天1次，连续给药7 d。第7天给药1 h后，依次将小鼠置于喷雾器中，浓氨水恒压定量喷雾10 s，立即取出，观察小鼠是否腹肌收缩并同时张开大口，以此为标准，计咳嗽一次，统计小鼠开始咳嗽的时间（咳嗽潜伏期）。同时，继续观察并记录3 min内小鼠的咳嗽次数。

抗炎试验［9-11］：取小鼠30只，分组及给药方法同上。第7天给药40 min后，依次在小鼠右耳的两面分别涂以0.04 mL二甲苯致肿，其中正常对照组为小鼠左耳，1 h后处死，分别在小鼠正常对照组左耳和二甲苯右耳的同一部位，用直径5 mm的打孔器打下耳片，分别称定质量，记录，计算耳肿胀率，公式为肿胀率=（右耳质量-左耳质量）/左耳质量。

镇咳、抗炎实验结果分别见表8、表9。由表可知，与模型对照组比较，水提醇沉组具有明显的延长小鼠咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数、抑制小鼠耳肿胀率的作用（P＜0.05）；与原水提组比较，水提醇沉组疗效无显著性差异（P＞0.05）。

表8　水提醇沉组对浓氨水致小鼠咳嗽的影响（±s，n=10）

表8　水提醇沉组对浓氨水致小鼠咳嗽的影响（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05；与原方组比较，▲P＞0.05，下同。

组别　　剂量/（g.kg-1）咳嗽潜伏期/s 3 min内咳嗽次数模型对照组　　—　16.00±1.94　 50.50±8.22原水提组 　10　84.50±9.43*　14.00±3.37*水提醇沉组　10　87.10±8.44*▲12.50±2.80*▲

表9　水提醇沉组对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（±s，n= 10）

表9　水提醇沉组对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（±s，n= 10）

组别　　剂量/（g.kg-1）　　肿胀率/％模型对照组　　—　168.6±6.3原水提组　10　50.1±10.1*水提醇沉组　10　52.1±2.3*▲

3 讨论

岩豇豆（又名石吊兰）是二岩虎果汤的君药，而石吊兰素为岩豇豆的有效成分，研究表明其具有良好的镇咳、抗炎等作用［12］，与复方二岩虎果汤的功能主治一致，所以本实验选择石吊兰素作为二岩虎果汤水提醇沉工艺的含有量测定指标。为考察提取是否完全，除石吊兰素含有量外，还应兼顾浸膏得率，鉴于前者比后者能更好地反映药材的提取情况，故设计两者的权重系数为7∶3。

据报道，单味石吊兰药材在流动相为甲醇-1％醋酸（85∶15），检测波长为335 nm时，石吊兰素的出峰时间为10.2 min［13］。本实验参照药典标准，以甲醇-水（68∶32）为流动相［14］，标准品石吊兰素的出峰时间为11.9 min，但供试样品出峰杂乱，未分离出石吊兰素的色谱峰。考虑到研究对象为复方，成分复杂，主峰前面有杂峰，分离度达不到要求，因此调整了流动相比例。最终，确定以甲醇-水（50∶50）为流动相时，石吊兰素的出峰时间为69.9 min，虽然出峰时间偏长，但分离效果良好，而且该比例下流动相经多次重复试验证明，其分离效果和出峰时间稳定，因此予以采用。

由于本方各味药材含多糖、淀粉量较多，水提浸膏得率较高，会导致给药剂量过大，而且这些杂质还可能造成制剂不稳定，所以后续进行了醇沉除杂工艺研究。结果显示，药液的相对密度在实际操作中不易控制，故以药材量与药液的体积比代替，方便实用。

另外，二岩虎果汤的传统剂型为水煎剂，为确保水提醇沉工艺不影响其疗效，本实验进行了药效学验证。结果表明，水提醇沉工艺产品与水煎剂比较，止咳、抗炎作用无差异，进一步说明该工艺的可行性。

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［14］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：84.

*通信作者：覃容贵（1970—），女，博士，教授，主要从事中药资源及药理研究。Te1：（0851）6908218-709，E-mai1：1346812934@ qq.com

作者简介：罗忠圣（1971—），男，副主任药师，主要从事中药制药及新药研究工作。Te1：13885086747，E-mai1：1052318167 @ qq.com

基金项目：贵州省科学技术基金项目（黔科合J字［2012］2328号）；贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题（QZYY2011-86）

收稿日期：2014-09-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.047

中图分类号：R284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0193-05