内质网应激与氧化应激：恶性循环还是双刃剑？

邱艳丽，李巧稚，郑亚琴，李　倩



内质网应激与氧化应激：恶性循环还是双刃剑？

邱艳丽，李巧稚，郑亚琴，李倩*

目的综述内质网应激与氧化应激之间相互作用关系的研究进展。探讨氧化应激与内质网应激相互作用诱发相关疾病的机制。方法阅读国内外文献数据库中相关文献，尤其是近年来关于氧化应激与内质网之间关系的文献，结合临床，从疾病诱发机制等方面对文献进行整理和综述。结果根据疾病背景，促进细胞存活的治疗策略主要在于加强保护未折叠蛋白反应(UPR)信号响应，衰减内质网应激水平，或者灭活UPR促凋亡化合物；而从氧化应激出发，控制氧化应激水平，减弱内质网应激是控制疾病发作的重要方法。结论本文对两种应激关系的研究近况进行整理总结，为相关疾病发病机制的深入研究和临床应用提供理论依据。

内质网应激；氧化应激；相互作用

0　引言

内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是一种存在于真核细胞中的细胞器，主要负责合成、折叠、修饰和转运蛋白。此外，ER在保持固醇类、脂质类和碳水化合物生物合成及体内Ca2+平衡等方面也具有重要作用。只有正确的折叠蛋白才能从ER转运至高尔基体中。任何干扰氧化还原的调控都能够导致内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)，其中未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)是细胞内的信号传导途径，调节ER蛋白质折叠，会导致错误折叠，改变蛋白质稳态。研究表明，ER蛋白质氧化的副产物中蛋白质折叠和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生有密切联系。氧化应激(Oxidative stress，OS)时，UPR激活是一个自适机制，以维护细胞的功能和存活。持续OS和蛋白质错误折叠会引起凋亡级联，在多种疾病(包括糖尿病、动脉粥样硬化和神经系统变性疾病的发病机制中发挥主导作用)，然而，ERS诱发疾病的发病机制仍不明确，研究表明其与OS有关。本文对ERS与OS之间相互作用诱发疾病的相关机制作初步概述，现报道如下。

1　内质网应激

内质网修饰蛋白的常见方法包括N-糖基化、二硫键形成和低聚，此过程需要分子伴侣。常见的分子伴侣包括：蛋白质二硫键异构酶(PDI)、ERp29、热休克蛋白70家族成员(BiP/GRP78)、钙联接蛋白(CRT)、钙网蛋白和肽基异构酶家族[1]。ERS可以与OS、炎症反应及蛋白质合成降解等多种信号通路偶联，通过偶联下游的多种信号分子对细胞的代谢、氧化和抗氧化、蛋白质合成和降解、增殖与凋亡、炎症反应等生理病理活动进行调控[2]。因此，ER是细胞质量控制的检查点。常见的ERS主要激活3条信号通路：UPR、超负荷反应(Endoplasmic reticulum overload response，EOR)和固醇调节级联反应。在真核细胞中，UPR被3个ER跨膜蛋白激活：PERK(双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶)、IRE1(需肌醇酶1)和ATF6(激活转录因子)。在非应激和正常的生理条件下，这些蛋白处于不活跃的状态，与ER的分子伴侣BIP/GRP78相结合。当ER应激时，BIP/GRP78与3个ER跨膜蛋白解离，导致UPR激活[3]。ERS后可引起内质网腔中错误折叠和未折叠蛋白的聚集，破坏内质网内Ca2+动态平衡。在转基因小鼠的研究中发现，UPR途径与许多生理过程和疾病相关[4-5]，引起人们关注[6]。

2　氧化应激

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS和活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。即体内氧化与抗氧化系统失衡，倾向氧化，导致中性粒细胞炎性浸染，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。细胞中ROS的内源性来源主要为线粒体电子传递链(mETC)，有氧呼吸的过程中，正常情况下，O2主要在线粒体呼吸链末端氧化酶的作用下还原成H2O，只有少量O2-(2%～3%)从电子传递链上泄露出来，但在病理状态时，会有大量O2-泄露出来。除mETC外，低水平ROS是由膜定位的NADPH氧化酶(NoX)、过氧化物酶和细胞色素P450系统产生的[7-10]。

3　内质网应激与氧化应激的关系

3.1氧化应激引起内质网应激

3.1.1ROS和UPRUPR是指由于缺氧缺血、OS等因素引起ERS时，应激信号由ER传到细胞核中，继而引发一系列特定的靶基因和蛋白质翻译水平下降，以维持细胞正常功能的一种自我保护机制。但当EOS过强时，ER的功能紊乱得不到修正，造成UPR超载，即细胞启动细胞凋亡程序，最终可能导致细胞坏死和组织损伤。

3.1.2ROS和超负荷反应PDI是内质网腔内保证正确折叠蛋白的一类酶，其功能为催化二硫键的形成和构建二硫键的重排。ER是细胞的钙存储器，参与钙稳态和钙介导的信号途径。新生成的蛋白质在ERS内适当折叠，其成熟和定位都需要ER高度氧化和丰富的钙环境。ER高度氧化和丰富钙环境对于蛋白质翻译修饰(包括糖基化和二硫键的形成)是必要的[11]。目前研究表明，ROS对蛋白质折叠二硫键形成的作用有2种机制。①二硫键的形成是由EOR1、稳定的FAD依赖酶和PDI所决定的。在二硫键的形成过程中，PDI接受从多肽底物半胱氨酸残基的2个电子，转给ERO1，启动了另一个二硫键循环途径[12]。ERO1从PDI接受电子后传递给分子氧，同时产生H2O2，后者成为ER腔中主要的ROS。ROS生成蛋白质错误折叠导致谷胱甘肽(GSH)消耗，使GSH被氧化生成氧化谷胱甘肽(GSSH)。真核细胞中的非蛋白硫醇具有抗氧化功能，可修复GSH和ERO1/PDI之间的关系，使GSSH还原为GSH。GSH和GSSH之间的平衡对于细胞的氧化还原稳态的维持是至关重要的。GSH/GSSH比率的串扰导致错误蛋白质的折叠和ROS生成增加[13-14]。在蛋白质错误折叠的过程中，二硫键的断裂和形成是一个重复的周期，每个周期中都会产生ROS副产物。GSH消耗的同时，ER中的UPR接受线粒体产生ROS，导致细胞死亡。②ROS的生成独立于二硫键的形成。在ER中，未折叠蛋白的积累导致Ca2+泄露进入细胞液中，增加了线粒体中ROS的产生。两种机制最终导致线粒体ROS的产量增加，影响线粒体电子传递链生成ATP。因此，ROS的生成和OS可以视为UPR的有机组成部分。即ROS生成可以在UPR反应中的上游和下游起作用，证明ERS和OS相互作用[15]。

3.1.3ROS是触发内质网应激介导凋亡通路的上游信号分子研究表明，ER应激对于细胞凋亡起重要作用。有报道，CHOP是ER应激反应在细胞凋亡方面起作用的重要因素，能诱导和上调UPR的3条信号通路。诱导的适应性反应称为UPR，3种主要应激信号控制UPR依赖性反应，包括IRE1α、PERK和ATF6。ER跨膜转换因子可恢复蛋白的折叠能力。激活的IRE1α 特异性地剪切核苷酸基因内区的mRNA编码转录因子XBP1，促进XBP1转录和表达，进而上调UPR。IRE1α可促进激活ASK1(凋亡信号激酶1)，激活下游应激激酶Jun-N终端激酶(物)和P38 MAPK，促进细胞凋亡[16-17]。最近，关于果蝇和鼠的细胞研究显示，RIDD减少ER胞浆中的mRNA。RIDD选择性目标信使RNA编码的蛋白质参与蛋白质折叠，持续激活RIDD能够促进细胞死亡，整个过程与IRE1α构象相关[18-19]。ER、OS通过产生ROS，可能增加内质网腔内钙的泄漏，通过多种机制刺激线粒体活性氧的生产。线粒体ROS量主要反映泛半醌自由基中间体QH.量，复合物Ⅲ受抑制时QH.增加。线粒体内产生的高浓度ROS进一步促进ER内钙的释放，线粒体内钙的积累可增加线粒体活性氧的产生，导致通透性转换孔开放。此外，在ER膜，ROS可反馈给敏感的钙释放通道。如：通过活性氧或活性氮氧化兰尼碱受体中关键的巯基，并导致其失活，从而增加了钙从肌浆网的释放。随着细胞抗氧化电位的减少，钙释放的恶性循环与ROS生成使细胞存活更加受到威胁[20]。

3.2内质网应激诱发氧化应激一方面，ERS可通过UPR以及与线粒体之间的相互作用产生过多的ROS分子，如O2-、OH-等，诱导局部组织和细胞的OS；另一方面，ERS可通过自身跨膜蛋白相关途径的活化而激活抗氧化转录因子，上调众多抗氧化酶的表达，均可对抗OS，维持细胞内环境氧化/抗氧化的平衡[21-23]。ROS高水平沉积能够导致蛋白损伤，进一步导致ERS。内质网在胞内蛋白折叠和修饰中起重要作用，ROS水平过高明显诱导内质网中蛋白的错误折叠，激发ERS。反之，延长ERS可以诱导ROS产生[24-26]。

3.3氧化应激与内质网应激相互作用所涉及通路

3.3.1PERK-eIF2α通路PERK属于Ⅰ型内质网跨膜蛋白，包括在内质网腔中的N端和在胞质中的C端。当ROS进入内质网并直接进攻蛋白折叠酶上游离的巯基，可使ER腔内未折叠蛋白质增多，进而诱导免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin-binding protein，BiP)和PERK解离，结合未折叠的蛋白质，减少ER中未折叠蛋白的积累。解离的PERK形成寡聚物并发生自身磷酸化和二聚化。活化的PERK使底物eIF2α (Eukaryotic translation initiation factor-α)特异性磷酸化，失去启动蛋白质翻译的能力[27-28]。

3.3.2IRE1α-XBP1通路IRE1α属于内质网中的Ⅰ型跨膜蛋白，哺乳动物细胞中有2个Ire1P 同源物：Ire1α、Ire1β。Ire1α在各组织细胞中广泛存在，而Ire1β仅存在于消化道上皮细胞，两者均具有与Ire1P相同的3个功能域[29]。IRE1α在细胞中广泛存在，正常情况下，IRE1α与内质网中的分子伴侣BIP/GRP78结合，而当ROS诱发内质网中未折叠蛋白的蓄积引发ERS时，诱导ER膜上IRE1α胞浆的结构域低聚和自身磷酸化而被激活。激活的IRE1α特异地剪切核苷酸基因内区的mRNA编码转录因子XBP-1，促进转录因子XBP-1s (X-box binding protein-1 splicing)转录[30]。

3.3.3ATF6通路ATF6是真核细胞内质网膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，在哺乳动物细胞中有2种亚型：ATF6α、ATF6β[11,31]。ATF6由Ire1α、Ire1β活化，使XBP-1mRNA的内含子被剪接，从而翻译成转录因子。ATF6过表达能够激活哺乳动物细胞中的未折叠蛋白反应的相关靶点。内质网内腔中的ATF6与Ire1、GRP78相互作用，在ATF6上组合形成高尔基体定位的信号序列。当ROS诱发内质网中未折叠蛋白的蓄积引发ERS时，ATF6与GRP78分离，暴露高尔基体定位信号序列，介导ATF6进入高尔基体，在高尔基体内ATF6被S1P、S2P蛋白酶裂解，N末端bZIP结构域从膜上脱落进入胞核，从而激活转录因子XBP-1和其他折叠蛋白反应靶基因，引发UPR[32]。

3.3.4三条通路的结合作用通常，哺乳动物中UPR的传导激活机制是受限制的。但在酵母菌中，已有IRE1的直接识别机制。而哺乳细胞中，体外研究表明，IRE1α激活的直接识别机制尚不明确。近期报道显示，在哺乳细胞中，IRE1β可能直接绑定未折叠蛋白，和酵母中IRE1相似。绑定和分离BiP作为ER应激激活信号。在慢性ER应激条件下，如：ATF4的诱导及其下游的目标CHOP导致凋亡，可能通过Bcl-2家族促细胞凋亡转录。GADD34表达可能使细胞敏感死亡，其在应激细胞中恢复细胞的形成。IRE1α激活也会通过2个不同的机制参与细胞的死亡过程：①激活ASK1、JNK；②持续的RIDD。在ER中，过多的活性氧的产生和钙离子的释放可导致细胞不可逆的损伤。在信号行为之间的显著差异可能使XBP1表达保护影响消失，增强ATF4和CHOP下游细胞的凋亡[13]。

4　氧化应激和内质网应激相互作用，互为因果

有研究显示，在胸腺癌细胞中，白蔹素(AMP)会增加ROS的产生，诱导由ERS产生的GRP78和CHOP的表达。ROS清除剂NAC阻断ROS产生时，大大降低了AMP诱导的GRP78和CHOP的表达，说明ROS的生成拮抗了由AMP诱导的ERS的上游物质。通过RNA干扰，对抗CHOP产生的UPR通路，明显抑制了ROS的产生。表明AMP诱导的ROS能诱发下游的UPR激活和ER应激，增加ROS的产量。虽然准确的潜在机制尚不明确，但研究表明，OS和ERS可能会形成恶性循环[16]。

所有细胞器中均可以产生ROS，最终导致蛋白质损害。此外，生物系统暴露于各种OS条件下会导致细胞水平的氧化修饰蛋白、脂质和核酸增加，随后诱发疾病发展，引起认知功能和代谢完整性受损。研究表明，蛋白质折叠和ROS的产生密切相关，如内质网应激可以引起ROS的生成，氧化应激可以通过引起UPR反应，保护细胞功能，并维持其存活。另外，神经学研究表明，6-羟基多巴胺引起的氧化可能会引起内质网应激或UPR，最终导致细胞死亡。氧化应激与内质网应激作用可以互为因果[33]。发生在ER中的氧化蛋白质折叠以及蛋白质折叠扰动会引起损害，改变氧化还原状态；活性氧的产生可直接或间接(或两者)影响ER稳态和蛋白质折叠。结果表明，OS和氧化蛋白质折叠之间的关系可能为今后研究的主要领域[34]。

5　总结

在多种疾病中，ER功能障碍是重要的影响因素，可调节细胞存活和细胞死亡的机制。根据疾病背景，促进细胞存活的治疗策略可能包括加强保护UPR信号响应，衰减ER应激水平，或者灭活UPR促凋亡化合物；而从OS出发，控制OS水平、减弱ERS是控制疾病发作的重要方法。目前，ERS和OS的相互作用机制尚不明确。需要进一步研究其对体内蛋白质折叠、错误折叠和分泌的影响，阐明蛋白质错误折叠可能导致OS及细胞凋亡的机制；针对此领域的深入研究有助于理解ERS和OS的相互作用，及其如何被整合到其他细胞信号途径中；对蛋白质错误折叠和OS之间关系的研究可促进药物制剂的发展；加强ERS和OS信号途径机制的理解，可能有助于相关疾病的选择性、特异性药物的开发。

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Interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress

QIU Yan-li,LI Qiao-zhi,ZHENG Ya-qin,LI Qian*

(College of Pharmacy,Harbin Medical University,Harbin 150081,China)

ObjectiveTo summarize the research progress in the interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress.MethodsResearch articles about the interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress were reviewed and summarized according to clinical use and disease mechanisms.ResultsTreatment strategies that promoted cell survival mainly focused on strengthening the protection of UPR response signal,attenuating ER stress level,or inactivating UPR pro-apoptotic compound according to the disease.Regulating oxidative stress level and weakening ERS was an important method to control the disease from the aspect of oxidative stress.ConclusionThis paper summarizes the researches in interaction between endoplasmic reticulum stress and oxidative stress,providing theoretical evidence for the research in diseases-related pathogenesis and further clinical application.

ER stress;Oxidative stress;Interaction

2016-04-26

哈尔滨医科大学药学院，哈尔滨 150081

国家自然科学基金(31100835)；黑龙江省科学基金资助面上项目 (12015-65/H2809)；中国博士后面上基金资助(2013M531066)；黑龙江省博士后资助 (LBH-Z11059)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608030