HPLC梯度洗脱法同时测定镇痛活络酊中4种成分的含量

沈　健，张诚贤



HPLC梯度洗脱法同时测定镇痛活络酊中4种成分的含量

沈健1*，张诚贤2

目的建立同时测定镇痛活络酊中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B含量的高效液相色谱法。方法采用依利特C18柱；流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脱；流速：1.3 mL/min；柱温：26 ℃；检测波长λ1=254 nm (香蒲新苷及异鼠李素-3-O-新橙皮苷)，λ2=285 nm [巴西苏木素和(±)原苏木素B]。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B的线性范围分别为4.62～92.40 μg/mL (r=0.999 2)、5.70～114.00 μg/mL (r=0.999 6)、8.95～179.00 μg/mL (r=0.999 4)、7.79～155.80 μg/mL (r=0.999 7)；香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B的平均加样回收率分别为97.81%、99.16%、97.23%、96.74%，其RSD分别为1.19%、0.84%、1.04%、1.08%。结论所建立的镇痛活络酊样品中，4种成分(香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B)的含量测定方法准确、可靠。

高效液相色谱法；镇痛活络酊；香蒲新苷；异鼠李素-3-O-新橙皮苷；巴西苏木素；(±)原苏木素B

0　引言

镇痛活络酊是由蒲黄、苏木、草乌、半夏、川乌、樟脑等17味中药组成的中药复方制剂，按照《国家中成药标准汇编·骨伤科分册》规定的质量标准加工而来，该制剂的主要功效为舒筋活络、祛风定痛，主要对急慢性软组织损伤、关节炎、肩周炎、颈椎病、骨质增生、坐骨神经痛及劳累损伤等筋骨酸痛病症有显著的治疗作用[1-2]。原部颁的镇痛活络酊标准仅对处方中大黄所含的大黄酚进行了含量测定研究，而镇痛活络酊是由17种中药材按照质量标准中规定的生产工艺加工制成的复方制剂，仅控制其中1个成分不能有效地确保镇痛活络酊的质量。本研究应用高效液相梯度洗脱法，对该制剂的蒲黄、苏木中的4个成分-香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B进行含量测定，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器安捷伦1200型HPLC色谱仪；恒温超声波提取机(型号：VS-100UE，生产厂家：无锡沃信仪器有限公司)；XS205DU型电子天平(梅特勒-托利多)。

1.2试药香蒲新苷对照品(批号：111573-201405，含量：97.0%，常温保存)、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品(批号：111571-201205，含量：93.2%，室温干燥保存)、巴西苏木素(批号：111881-201302，含量：94.9%，冷冻避光保存)、(±)原苏木素B(批号：111882-201302，含量：89.9%，冷冻干燥避光保存)，以上4种对照品均来源于中国食品药品检定研究院；镇痛活络酊(50 mL/瓶；批号：20140807、20140802、20140701)购自上海景峰制药股份有限公司；试验用乙腈为色谱纯，试验用乙醇、磷酸为分析纯，试验用水为重蒸馏水。

2　方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品储备液的制备取对照品香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B适量，精密称定其质量，加60%乙醇溶解并稀释，分别制成香蒲新苷为0.462 mg/mL、异鼠李素-3-O-新橙皮苷为0.570 mg/mL、巴西苏木素为0.895 mg/mL和(±)原苏木素B为0.779 mg/mL的对照品储备液。

2.1.2混合对照品溶液的制备分别吸取“2.1.1项”下香蒲新苷对照品储备液2.5 mL、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品储备液3.5 mL、巴西苏木素对照品储备液6.0 mL、(±)原苏木素B对照品储备液5.0 mL，用60%乙醇稀释，制成每1 mL分别含香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B为23.1、39.9、107.4、77.9 μg的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液和空白对照溶液的制备精密量取镇痛活络酊2.0 mL，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至刻度，采用超声波对样品进行超声(250 W，20 kHz)处理5 min，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤头过滤，作为供试品溶液。另外，按照镇痛活络酊质量标准中规定的处方工艺，分别制备不含蒲黄、苏木的空白制剂，同法制成蒲黄空白溶液和苏木空白溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验试验用色谱柱采用依利特C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.5%磷酸溶液，按表1规定的程序进行梯度洗脱[3-5]；检测波长：0～28 min，λ1=254 nm[6-9]，29～54 min，λ2=285 nm[10-11]；流速：1.3 mL/min；柱温：26 ℃；进样量：20 μL。在上述规定的系统条件下，所测4种成分香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B与其他成分均有良好的分离效果，理论塔板数按香蒲新苷计算不得低于2 500，分离度均>1.5。

表1　梯度洗脱程序(%)

2.3专属性试验分别精密吸取“2.1.3”项下制备的供试品溶液、“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液以及“2.1.3”项下制备的蒲黄空白溶液和苏木空白溶液，参照“2.2”项下色谱条件进行测定，在记录的色谱图中，按保留时间先后，所测4种成分的出峰顺序为：香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B。结果显示，供试品溶液和混合对照品溶液所测各成分的保留时间一致；蒲黄空白溶液中未显示香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷色谱吸收峰；苏木空白溶液色谱图中未显示巴西苏木素和(±)原苏木素B吸收峰。表明镇痛活络酊处方中，其他药物对所测4种成分-香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B的测定无影响，见图1。

2.4标准曲线的绘制分别精密吸取“2.1.1”项下制备的香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置于5个10 mL的容量瓶中，以60%乙醇定容至刻度，振摇均匀，制成5个不同浓度的混合对照品溶液。参照“2.2”项下的色谱条件进行分析测定，测定香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素及(±)原苏木素B各成分的峰面积，以峰面积A为纵坐标、对照品质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素及(±)原苏木素B的回归方程、线性关系及r值见表2。

2.5精密度试验取文中“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液，参照文中“2.2”项下规定的色谱条件，连续进样6次，测定香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素、(±)原苏木素B的峰面积，计算各成分相对标准偏差依次为：1.29%、0.97%、0.53%、1.05%。

图1　镇痛活络酊中4种成分HPLC色谱图

表2　线性关系考察结果

2.6重复性试验按样品含量测定方法对同一批号的6份镇痛活络酊样品进行测定，记录峰面积，计算相对标准偏差，结果显示，香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B的相对标准偏差分别为1.31%、0.89%、0.67%、1.51%，表明重复性良好。

2.7溶液的稳定性试验取同一批次镇痛活络酊样品的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算各成分RSD，结果显示，香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B的RSD分别为0.95%、1.51%、0.79%、1.83%，表明供试品溶液在室温下存放24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验取9份已知含量的镇痛活络酊[香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B分别为0.617、1.024、2.676、1.971 mg/mL]适量，精密量取1.0 mL，置50 mL容量瓶中，分别精密加入“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液20、25、30 mL各3份，按照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法制备，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤头过滤，作为加样供试品试液。参照“2.2”项下色谱条件进行分析测定，计算4种成分的回收率，结果见表3。

2.9样品测定取3个不同批号的镇痛活络酊样品，参照“2.1.3”项下制备供试品溶液的处理方法，按“2.2”项下色谱条件测定4种成分的含量，结果见表4。

3　讨论

3.1检测波长的选择本研究分别配制一定浓度的各成分对照品溶液，采用UV-3200PC 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)在190～400 nm范围内分别进行紫外吸收光谱扫描，结果香蒲新苷在252 nm波长处有最大吸收，异鼠李素-3-O-新橙皮苷在255 nm波长处有最大吸收。参考《中国药典》(2010年版)蒲黄含量测定项下的检测波长为254 nm，将本试验香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的检测波长定为254 nm。巴西苏木素在203、286 nm处有较强吸收，(±)原苏木素B在206、283 nm处有较强吸收，考虑到200 nm附近溶剂有强吸收，同时参考《中国药典》(2010年版)苏木含量测定项下的检测波长为285 nm，将本试验巴西苏木素和(±)原苏木素B的检测波长定为285 nm。

表3　加样回收率试验(n=9)

表4　样品含量测定结果(mg/mL)

3.2流动相的选择笔者曾采用乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液不同比例为流动相进行梯度洗脱，结果显示，以乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)按照文中规定的程序进行梯度洗脱时，所测4个成分-香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和(±)原苏木素B的峰形良好，各成分均能达到基线分离。

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Simultaneous determination of four components in Zhentong Huoluo Ding by HPLC

SHEN Jian1*,ZHANG Cheng-xian2

(1.Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China;2.Huzhou Institute for Food and Drug Control,Huzhou 313000,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of 4 main components in Zhentong Huoluo Ding,including typhaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B.MethodsA stable HPLC method was established and the chromatography was accomplished on an Hypersil C18column,with a mobile phase consisting of acetonitrile (A) and 0.5% phosphoric acid solution (B) in a gradient elution.The flow rate was set at 1.3 mL/min,and the column temperature was set at 26 ℃.Typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidoside were detected at 254 nm,while brazilin and (±) protosappanin B were detected at 285 nm.ResultsTyphaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B had good linearity at 4.62～92.40 μg/mL (r=0.999 2),5.70～114.00 μg/mL (r=0.999 6),8.95～179.00 μg/mL (r=0.999 4) and 7.79～155.80 μg/mL (r=0.999 7),respectively;the average recovery rates were 97.81% (RSD=1.19%),99.16% (RSD=0.84%),97.23% (RSD=1.04%) and 96.74% (RSD=1.08%),respectively.ConclusionThe developed HPLC method is accurate and reliable for the simultaneous determination of typhaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B in Zhentong Huoluo Ding.

HPLC;Zhentong Huoluo Ding;Typhaneoside;Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside;Brazilin;(±)protosappanin B

2016-03-08

1.湖州市中心医院，浙江 湖州 313000；2.湖州市食品药品检定研究院，浙江 湖州 313000

10.14053/j.cnki.ppcr.201608025