灵芝三萜液体发酵技术研究进展

黎李平 张容容 雷含珺 王晓玲



灵芝三萜液体发酵技术研究进展

黎李平 张容容 雷含珺 王晓玲*

（中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙 410004）

灵芝三萜是灵芝的重要药效成分，液体发酵技术是大量获取灵芝三萜的重要途径。概述灵芝发酵产三萜的菌株筛选，培养基优化和发酵技术，三萜液体发酵动力学，三萜生物合成的相关酶和基因表达调控等，综述灵芝三萜液体发酵的最新研究进展，并对今后的相关研究进行了展望。

灵芝；灵芝三萜；液体发酵；发酵动力学；研究进展

灵芝药用价值很高，自古以来被人们视为延年益寿的药材，特定的灵芝种又名赤芝（学名，过去曾一直用）[1]。三萜和多糖是灵芝最主要的两大类活性成分。灵芝三萜化学结构较复杂，分子量一般为400～600。依据结构和官能团不同，灵芝三萜包括灵芝酸、灵芝孢子酸、灵芝内酯、灵芝醇、灵芝醛、赤灵酸、灵赤酸、赤芝酮等约20类化合物。现代药理研究证明，三萜类化合物具有抗肿瘤、防止动脉硬化、保肝、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、提高免疫力、抗衰老等多种功能[2～6]。传统栽培的灵芝，子实体形成周期长，劳动强度大。发酵技术的发展使其成为大规模工业化生产活性物质的主要方法[7，8]。通过发酵技术生产灵芝三萜已成为国内外的研究热点。本文从灵芝发酵菌种的筛选，液体发酵工艺的优化以及三萜发酵动力学、三萜合成调控等方面，对液体发酵合成和获取灵芝三萜的最新研究进展进行综述。

1 灵芝三萜发酵菌株的研究

灵芝属的种质资源十分丰富，仅在我国就发现98种，但目前对灵芝的研究主要集中在赤芝和松杉灵芝（）两个种。杨晓彤等对5个种的20多个菌株的液体发酵研究发现，除药典批准的和2个种外，其余3个种也可在发酵过程中产生含量与之接近并有抑瘤活性的灵芝三萜[8～10]。研究还发现，就同一种而言，菌株差异也显著影响三萜的产量。在发酵中选用经过筛选的特定菌株是提高三萜产量的有效途径之一。如余素萍等已在种内筛选出三萜高产菌株31[11]。

在菌株诱变选育方面，李刚等通过原生质体紫外诱变，成功获得了2株代谢产物含量和产量明显高于原始菌株的诱变株[12]。陆正清等采取原生质体融合等方法打破灵芝菌丝体的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，从而得以快速生长并大量积累目标代谢产物灵芝酸等[13]。

迄今，灵芝菌株的研究仍停留在传统的菌株筛选，采用基因工程手段改良菌株的相关研究尚未见报道。

2 灵芝三萜液体深层发酵工艺

2.1 培养基及其优化

目前，已有许多学者对灵芝液体发酵培养基成分进行了优化研究，但是由于研究的供试菌株及原材料不同，培养基优化的结果也不尽相同，难以相互比较。

（1）碳源。刘冬等对15种常用碳源进行筛选研究，发现最适碳源为葡萄糖[14]。Fang Q.H.等研究表明，灵芝以葡萄糖为碳源时，其最适浓度为2%～5%[15]。白芳静等的试验结果与其一致，葡萄糖浓度过高（如8%），不利于菌丝生长和产物形成[16]。Xu Peng等研究碳源对灵芝菌丝体生物量和三萜酸产量的影响，结果发现葡萄糖有利于菌丝体生长，而玉米粉则有利于三萜酸的积累，当以两者作为复合碳源时菌丝体生物量和三萜酸产量均可显著提高，分别比对照组提高了18%和64%[17]。以上研究均表明灵芝菌株较适宜的碳源多为葡萄糖。葡萄糖的成本较高，Zapata P.等为降低培养基成本，试验以大麦粉和NH4Cl为主要基质同时发酵生产灵芝菌丝体、多糖和灵芝酸（灵芝三萜），结果表明，灵芝菌丝体可达23.49 g/L，灵芝酸的产量也达到较高水平，为299.67±11.63 mg/L[18]。

（2）氮源。灵芝的较适宜的氮源多为有机氮源，如蛋白胨或酵母浸粉[7,15,17,19]。Fang Q.H.研究表明当碳源不变，以酵母浸粉和蛋白胨混合作为复合氮源发酵培养，添加量各为5 g/L时灵芝酸产量最高[19]。此外，碳氮比对菌丝生长和三萜产物的形成具有重要影响。杨焱等研究发现灵芝发酵过程的C/N比值在18～25之间对多糖的生成最为有利。根据C源的合适浓度，N源在培养基中的比例应为0.1%～0.2%[20]。

（3）无机盐离子。灵芝在液体发酵过程中添加少量的无机盐有利于目标产物的产生。分析已有文献发现，通常Mg2+、K+和P5+是灵芝菌丝体正常生长的必要条件[15,17,19]。刘东等研究表明K+、Mg2+、P5+的缺乏尤其是K+的缺乏对菌丝体生长影响较大[14]。胡志斌等探讨不同水平的亚硒酸钠对灵芝菌丝体生长的影响，发现硒对灵芝菌丝生长有促进作用，在浓度为250 μg/mL时其生物量最大[21]。姚强等试验发现，适当质量浓度的稀土元素可以显著提高灵芝多糖和三萜的产量，其中镨元素对多糖和胞内三萜的合成效果较明显，而镧元素对胞外三萜合成的诱导效果较好[22]。

2.2 发酵条件

（1）pH。pH对菌丝体生长影响极大，过酸过碱都不利于其生长。灵芝菌丝体在偏酸性条件下生长较好，一般培养灵芝的适宜pH范围为5.0～6.5。但针对生产不同产物的最适初始pH并不相同。Fang Q.H.等研究表明以菌丝体生物量和灵芝酸为目标时，初始pH最佳为6.5左右，即为培养基的自然pH[23]。Leandro P.等发现pH为3.5时胞外多糖产量高[24]。卫军等研究发现pH为6.5时其菌丝体生物量大[25]。pH梯度或阶段控制有利于重要产物如灵芝酸的形成。Tang Y.J.等在灵芝液体发酵过程中，通过两阶段pH控制技术，即发酵的前4天控制pH 3.0，后6天控制pH 4.5时，灵芝酸的产量提高到321.6mg/L，效果显著[26]。

（2）温度。灵芝发酵的生长温度范围较广，考虑到菌株差异及其他发酵因素的影响，选择合适的温度极其重要。适合菌丝生长的温度为25～28 ℃，而宋景平等研究表明，稍高于此范围的温度（27～30 ℃）能提高目的三萜的产量[27]。卫军等研究表明菌丝体在28 ℃时生长迅速，生物量达到最大[25]。而Chang M.Y.等研究发现菌株生长最适温度为34 ℃[28]。

（3）培养时间。灵芝摇瓶培养研究发现，发酵过程的产物形成时间的顺序依次为：胞外多糖，三萜。选择合适的培养时间是关键。余素萍等收取不同培养时间的菌丝，发现培养前期的三萜类成分少，含量低，活性低，只有在培养96 h时生物量最大，且到达培养后期各组分不再增加，只在含量上发生改变[11]。徐济责等研究发现，最佳培养时间为5天，此时菌丝密度和生物转化率最大[29]。而王晓玲等在研究灵芝三萜酸分批发酵的非结构动力模型时发现，培养到3～7天时胞内三萜酸大量合成，而胞外三萜则于4～7天时大量合成，并都在第7天时达到最大[30]。在实际生产中应当按照对不同产物的要求选择恰当的培养时间。

（4）溶氧。灵芝是好氧性真菌，氧在灵芝三萜发酵过程中比较重要。李平作等发现，在25 L发酵罐内选择1︰0.75 v/（v·m）的通风量和180 r/min的转速效果较好。通风可增加最终生物量，较低的溶氧环境可促进灵芝酸的产量[31]。Xu J.W.等采用先通气振荡，后静置培养的方法培养菌丝体，结果显示灵芝酸产量明显提升[32]。因此，控制好溶氧量是灵芝发酵的重要调控策略之一。

（5）添加外源物质对三萜发酵的影响。灵芝发酵过程参数的优化和调控是常用于提高三萜产量的方法，但有时在其发酵体系中加入一些外源物质干预其代谢途径，也能获得高产量的目标产物。

已有研究结果表明，不同种类真菌激发子的不同浓度及添加时间都会对三萜类的产生发生不同的影响：顶头孢激发子在发酵初期以120 μg/mL的浓度加入培养物中，三萜类物质的积累提高了5.2倍；木霉木素激发子在后期（第5天）以80 μg/mL的浓度加入培养物中，三萜类物质的积累提高了4.0倍[33]。2012年毕澎洋考察了薏苡仁酯不同添加量及添加时间对灵芝深层发酵的影响，显示在发酵24 h时添加0.2%薏苡仁酯对促进灵芝酸的产生效果显著[34]。我们实验室曾将蜣螂添加到灵芝发酵体系中，结果灵芝胞外三萜的总含量显著增加，其产量从对照的220.2±9.7 mg/L提高到304.3±11.8 mg/L，且合成一个EGT-1新组分，鉴定为四环三萜化合物 lucitone C[35～37]。

3 灵芝三萜发酵动力学

王晓玲等利用Sigmoid函数构建灵芝细胞生长、底物消耗、胞内和胞外三萜酸的非结构动力学模型，通过Boltzmann拟合求解出各模型参数[38]。结果表明，各模型预测值较好地吻合实验值。灵芝细胞生长速率在第2.5天达到最大值（max），为0.700 d−1；葡萄糖比消耗速率在第2.4天达到最大值（qS, max）为1.060 d−1；胞内三萜酸比合成速率在第4.7天达到最大值（qITA, max），为11.345 mg/（g·d）；胞外三萜酸比合成速率在第5天达到最大值（qETA, max），为10.077 mg/（g·d）。这与徐鹏等的实验结果基本一致：细胞最大比生长速率μ为4.63×10-2h-1，葡萄糖最大比消耗速率qS, max为6.70×10-2h-1，灵芝酸最大比合成速率qGA, max为9.09×10-4h-1；灵芝酸的合成与细胞的生长呈现偶联关系，偶联系数αGA为0.020 4 g g-1[39]。

以上研究结果表明，Sigmoid模型在灵芝真菌生长和胞内外三萜酸形成规律的拟合方面有较好的适应性，研究结果为分批发酵法生产灵芝三萜酸提供了理论依据。另据灵芝发酵动力学的规律，控制发酵过程中的一些重要影响因子，将会显著改变发酵结果。灵芝三萜（灵芝酸）在发酵后期才迅速合成，根据这个特点，方庆华等[40]提出两阶段培养模式，即在4天摇床培养之后再接以12天的静置培养，相对于连续摇瓶7天的培养结果，灵芝酸产量大为提高（3.19 mg /100 mg干菌丝）。

4 灵芝三萜生物合成的相关酶和基因

三萜作为灵芝的重要药效成分，其提取、分离和药理作用方面已有大量研究，但灵芝三萜在灵芝细胞中是如何合成的，其合成途径怎样，涉及的相关合成酶和基因是什么等基础科学问题至今仍不明晰。目前国内外三萜合成的研究大多集中在植物中三萜的合成，对植物三萜合成前体的途径比较清楚，但最终三萜产物合成的具体途径和相对应的复杂的酶系统尚不明了。灵芝三萜的前期合成与其他植物中三萜的合成类似，都是从甲羟戊酸（MVP）开始，三萜前体至羊毛甾醇阶段的合成途径也与其他植物中三萜的合成途径类似。如Shang C.H.等经克隆其中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因，表达分析表明，HMGR与灵芝重要三萜（灵芝酸）的生物合成呈正相关，且认为HMGR是甲羟戊酸（MVP）的限速酶[41]。对另外两个灵芝合成前体的重要酶鲨烯合成酶（SQS）基因和2,3-环氧角鲨烯羊毛甾醇环化酶（OSC）基因的研究发现，这两个基因可以在灵芝菌丝生长阶段表达，但形成原基后的表达量显著提高，灵芝三萜含量分析也表明，在原基阶段的含量比菌丝体阶段的含量高[42，43]。说明这两个酶是灵芝三萜合成的关键酶。另据法呢基焦磷酸合酶（FPPS）基因表达的分析结果，FPPS基因也可以在灵芝菌丝生长阶段表达，但形成原基后的表达量显著提高。灵芝三萜含量分析还表明，在原基阶段的含量比菌丝体阶段的含量高[44]。可见FPPS也是灵芝三萜合成的关键酶。

上述研究初步了解了灵芝三萜合成前期的相关酶和基因，但迄今对于灵芝三萜最终产物的合成途径，即后期基因修饰和转化途径仍不清楚。近两年，灵芝的全基因组测序已完成：灵芝基因组大小约43.3 Mb，由13条染色体组成，编码16 113个预测基因。序列分析结果对灵芝三萜合成的有关基因有了初步了解，编码细胞色素P450（CYPs）的基因中有78 个CYP基因与灵芝三萜重要前体羊毛甾醇的合成酶（LSS）共表达，提示这些CYP可能与灵芝三萜的合成有关[45]。进一步分析，有280个基因被成功注释，其中包括3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因和24个编码细胞色素P450（CYPs）基因[46]。

5 展 望

目前，研究者们在优良菌株的选育、培养基的筛选、培养条件的优化、发酵工艺的改良等方面进行了大量的探索，提高了灵芝三萜发酵的技术水平。但在研究和生产中仍存在许多问题，如在工业化大规模生产中发酵培养基成本相对较高，需要不断寻找较廉价的新的培养基质，在保持发酵产量不显著降低的情况下，降低生产成本。在实验室阶段试验成功的一些较复杂的过程控制策略和技术，如连续发、补料分批分阶段发酵等技术在放大试验或者在实际规模化生产中会存在较大困难，一些技术环节很难实现，同时较复杂的技术过程还易染菌等问题均有待解决。因此，研究和开发适合规模化生产的灵芝三萜发酵技术是十分必要的。

在基础研究方面，国内外对灵芝三萜的研究主要集中在三萜组分的分离、结构鉴定、药理作用及其作用机制等方面。但对灵芝三萜合成的途径，以及合成途径的调控方面的研究还十分薄弱。此外，适合丝状真菌灵芝发酵生产三萜的相对柔和的生物反应器（发酵罐）的设计和试验研究也有待加强。随着灵芝三萜合成途径及合成调控基础研究的不断深入，相应高效定向发酵技术的不断成熟，以及各种相应大型生物反应器的研制成功，必将提高灵芝三萜的发酵水平和生产效率，推进灵芝三萜工业化生产的进程。

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Advances on triterpenes ofproduction by submerged fermentation

Li Liping Zhang Rongrong Lei Hanjun Wang Xiaoling*

（College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha, Hunan 410004, China）

Triterpenes is the key pharmacologically active ingredient of. Submerged fermentation is viewed as a promising alternative for efficient production of triterpenes of. In this paper, the research progress on the strain screening, fermentation media, process technology, fermentation kinetics, the related key enzyme and genes of triterpenes biosynthesis were reviewed. In addition, the future relevant research on triterpenes oflingzhi produced by fermentation is prospected.

; triterpenes; submerged fermentation; fermentation kinetics

S646

A

2095-0934（2016）05-294-06

湖南省高校创新平台开放基金项目（12K069）

黎李平（1991—），男，汉族，在读硕士生，主要从事食用真菌发酵技术研究

王晓玲，E-mail：cathy8311@163.com