代谢调节剂对三孢布拉氏霉菌发酵的影响

闫　兴， 向梦雄， 王常高，杜　馨， 林建国， 蔡　俊

(1 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室， 湖北 武汉 430068；

2 工业发酵湖北省协同创新中心， 湖北 武汉 430068)



代谢调节剂对三孢布拉氏霉菌发酵的影响

闫兴1,2， 向梦雄1,2， 王常高1,2，杜馨1,2， 林建国1,2， 蔡俊1,2

(1 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室， 湖北 武汉 430068；

2 工业发酵湖北省协同创新中心， 湖北 武汉 430068)

[摘要]三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素仍存在产物含量低、代谢调控方法单一等问题。为了进一步提高三孢布拉氏霉菌菌丝体中β-胡萝卜素的含量，通过向初始发酵培养基中添加不同的代谢调节剂，探究其对三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的影响。研究发现，发酵培养基中添加0.5%的丙酮酸钠、0.1%的Span-20、0.1%的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、3%的甘油均能提高β-胡萝卜素含量，其中抗氧化剂BHT的促进作用最大，β-胡萝卜素含量达到4.25 mg/g，相比空白组提高了72.1%。不同浓度的液体石蜡对β-胡萝卜素含量没有促进作用，但其促进生物量的增大,使β-胡萝卜素的产量得到提升。

[关键词]代谢调节剂； 三孢布拉氏霉菌； β-胡萝卜素

β-胡萝卜素(β-carotene)是一种天然的类胡萝卜素，其含有2个β-紫罗酮环和4个异戊二烯侧链，分子式为C40H56[1]。理论上1分子β-胡萝卜素可转化为2分子维生素A，故称为维生素A原，其具有抗氧化、抗癌、免疫等多种生物活性，主要应用于食品、保健品、化妆品、医药、饲料以及化工等领域[2-3]。目前，β-胡萝卜素的生产方法主要有化学合成法、天然提取法、生物合成法[4]。其中生物合成法由于不受环境因素以及原料、产地等的限制而受到广泛关注[5]。三孢布拉氏霉菌是β-胡萝卜素工业化生产的优良菌株，具有生物量大、单位菌体β-胡萝卜素含量高等优点[6]。但在工业化生产过程中仍存在着诸多问题，三孢布拉氏霉菌在液体培养基中易于结团，导致发酵液变得粘稠，影响传质和传热[7]。此外，反应器中溶氧浓度亦对其发酵生产β-胡萝卜素有影响。因此，对β-胡萝卜素的发酵工艺条件仍需进一步研究。本文根据三孢布拉氏霉菌的异化作用类型、β-胡萝卜素合成的代谢途径、发酵液的流体性质以及β-胡萝卜素的理化性质等特点，研究了氧载体、代谢前体物、表面活性剂、抗氧化剂等对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验菌株三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)，包括正菌ATCC 14271，负菌ATCC 14272，湖北工业大学轻工学部209实验室保藏。

1.1.2实验试剂马铃薯、大豆粉、玉米粉、大豆油，均为市售；玉米浆，山东潍坊盛泰药业有限公司；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，阿拉丁生物试剂公司；丙酮酸钠，BIOSHARP生物试剂公司；葡萄糖、甘油、液体石蜡、KH2PO4、MgSO4、VB1、Span-20，均为分析纯并购于上海国药集团。

1.1.3培养基斜面培养基：新鲜去皮马铃薯(煮沸取浸出液)，100 g/L；葡萄糖，20 g/L；琼脂粉，20 g/L；pH，自然。

种子培养基：大豆粉，30 g/L；玉米粉，30 g/L；KH2PO4，1 g/L；MgSO4，0.2 g/L；pH 6.5。

发酵培养基：葡萄糖，85.9 g/L；玉米浆，30 mL；，大豆油10 mL；KH2PO4，5.3 g/L；MgSO4，0.5 g/L。VB1，0.01 g/L；pH, 7.0。

1.2仪器与设备

ZSD-1270型全自动新型生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司； TG16-Ⅱ型高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司； ZHWY系列双层恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；GW-2000型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面培养三孢布拉氏霉正负菌分别接种至斜面培养基，置于28 ℃培养箱中培养5 d，待孢子长满整个斜面。

1.3.2种子培养正负菌各取一环孢子接种至种子培养基，种子培养基装于250 mL三角瓶中，装液量为50 mL。培养温度28 ℃，摇床转速200 r/min，正负菌培养时间分别为20 h和25 h。

1.3.3发酵培养将生长至对数期的正负菌株以1:9的比例按体积分数为6%的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基装于250 mL三角瓶中，装液量为50 mL。培养温度28 ℃，摇床转速180 r/min，震荡培养6 d。

1.3.4生物量(biomass)的测定摇瓶发酵结束后，将发酵液用双层纱布过滤，清水冲洗2次后，置于50℃真空干燥箱中烘干至恒重后称量。

w=(M2-M1)×20

式中：w为生物量，g/L；M1为纱布的质量，g；M2为烘干后纱布和干菌体的质量，g；20即将生物量单位由g/50 mL换算成g/L。

1.3.5β-胡萝卜素含量(β-carotene content)的测定将真空干燥后所得干菌体，用研钵研磨后准确称取0.01 g的菌丝体粉末，将称取的粉末加入50 mL石油醚避光萃取至无色。运用分光光度法在波长450 nm下测定其吸光度值，并依据标准曲线回归方程计算出菌丝体中β-胡萝卜素含量[8]

式中：φ为β-胡萝卜素含量；C为由标准曲线的回归方程算得的样品浓度，μg/mL；m为萃取所用的干菌体质量，g；V为萃取所用的石油醚体积，50 mL；1000即将β-胡萝卜素含量单位由μg/g换算成mg/g。

1.4试验设计

1.4.1液体石蜡对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响发酵培养基配制过程中依次添加液体石蜡0、10、20、30、40 mL，发酵6 d后分别测定生物量及β-胡萝卜素含量。

1.4.2丙酮酸钠对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响发酵培养基配制过程中依次添加丙酮酸钠0.25、0.5、0.75、1 g/L，发酵6 d后分别测定生物量及β-胡萝卜素含量。

1.4.3Span-20对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响发酵培养基配制过程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 mL，发酵6 d后分别测定生物量及β-胡萝卜素含量。

1.4.4BHT对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响发酵培养基配制过程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L，发酵6 d后分别测定生物量及β-胡萝卜素含量。

1.4.5甘油对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响发酵培养基配制过程中依次添加甘油0、0.5、1、1.5、2 mL，发酵6 d后分别测定生物量及β-胡萝卜素含量。

2结果与讨论

2.1液体石蜡对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响

三孢布拉氏霉菌的异化作用类型为需氧型，菌体生长过程中需要消耗大量氧气。液体石蜡作为一种新的液相添加到发酵培养基中，一方面增加氧气在其中的溶解度，另一方面减小气液传氧阻力，从而提高传氧效率，同时可以引起三孢布拉氏霉菌体中的氧化应激反应，从而提高SOD酶和CAT酶酶活，有利于β-胡萝卜素的合成[9-11]。

图 1　液体石蜡添加量对生物量和β-胡萝卜素含量的影响

从图1可以看出，添加不同浓度的液体石蜡可以促进生物量的增加，液体石蜡的添加量为2%时，生物量达到最大。但是液体石蜡对三孢布拉氏霉合成β-胡萝卜素并没有促进作用，反而抑制了β-胡萝卜素含量。可能由于其对微生物细胞有一定的毒性，导致了β-胡萝卜素含量下降，但β-胡萝卜素的产量仍有所提高。

2.2丙酮酸钠对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响

通过向发酵培养基中添加一定浓度的代谢前体物质，可以控制生产菌的合成方向和增加目标产物产量。当代谢前体物是合成过程中的限制因素时，前体物质加入量越多，目标产物产量越高。但前体物质的浓度越大，利用率越低，甚至对产物产生抑制作用。丙酮酸是EMP途径和TCA循环结点，一定浓度的丙酮酸能够促进产能的增多。同时其能够增加β-胡萝卜素合成过程中IPP途径通量，促进β-胡萝卜素的合成[12]。向发酵培养基中添加丙酮酸钠，其与丙酮酸具有相似的作用。

图 2　丙酮酸钠添加量对生物量和β-胡萝卜素含量的影响

从图2可以看出，当丙酮酸钠的浓度为0.5%时，生物量和β-胡萝卜素含量都达到最大。其添加量大于0.5%时，生物量呈下降趋势，β-胡萝卜素含量也降低但维持在一定水平。可能出现中间产物抑制作用，使代谢供能途径受阻，造成生物量下降。β-胡萝卜素代谢支路也受到一定的影响，使β-胡萝卜素含量降低至一定水平。

2.3Span-20对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响

表面活性剂不仅能够改变发酵液的流体性质，有助于三孢布拉氏霉菌菌丝体的分散，而且能够改变细胞膜的通透性，促进三孢布拉氏霉菌对培养基中营养物质的吸收及代谢物的分泌。Span-20具有特殊的疏水基团，并且比Span-60、Tween-80更易溶于水，具有独特的理化性质[13]。

图 3　Span-20添加量对生物量和β-胡萝卜素含量的影响

从图3可以看出，当Span-20的添加量为0.1%时，生物量和β-胡萝卜素含量都达到最大。继续增加Span-20的浓度，生物量和β-胡萝卜素含量减小，三孢布拉氏霉生长和代谢均受到抑制作用。可能由于高于0.1%浓度的Span-20对细胞膜的通透性进一步增大，导致部分细胞破裂，或吸附于细胞周围对细胞产生毒性，从而造成生物量的减少和β-胡萝卜素的流失。

2.4BHT对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响

β-胡萝卜素具有较强的还原性，发酵过程中易被空气中的氧气氧化。BHT作为抗氧化剂被添加到发酵培养基中，可以在一定程度上保护生成的β-胡萝卜素不被氧化，从而使β-胡萝卜素含量提高[14]。

图 4　BHT添加量对生物量和β-胡萝卜素含量的影响

从图4可以看出，添加不同浓度的BHT均对生物量和β-胡萝卜素含量有促进作用。可能由于BHT对菌体生长所需的还原性酶类有保护作用，另一方面对合成的β-胡萝卜素亦有保护作用。BHT的添加量为0.1%时，生物量和β-胡萝卜素含量达到最大。当添加量大于0.1%时，生物量和β-胡萝卜素含量均有不同程度的下降。可能由于高浓度BHT对细胞有一定的毒性，抑制了生物量和β-胡萝卜素含量。

2.5甘油对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响

甘油可以作为许多微生物利用的碳源，同时其还具有助表面活性剂作用。甘油被菌体代谢后产生丙酮酸，作为代谢中间物促进β-胡萝卜素的合成。另外，其促进菌丝分散，细胞膜通透性增加，使传质和传氧得到加强[15]。

图 5　甘油添加量对生物量和β-胡萝卜素含量的影响

从图5可以看出，培养基中添加3%的甘油，β-胡萝卜素含量达到最大。甘油浓度继续增大，β-胡萝卜素含量降低，但生物量仍旧呈上升趋势。可能由于过多的营养物质被用于前期合成菌体，对后期产物的合成供能不足。过量的甘油可能进一步增大细胞膜通透性，造成菌丝体中β-胡萝卜素含量减少。

3结论

1)通过研究多种代谢调节剂对三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素的影响，找到了不同代谢调节剂的最适添加量。研究发现，抗氧化剂BHT对提高三孢布拉氏霉菌菌丝体中β-胡萝卜素含量的促进作用最大，说明发酵过程中β-胡萝卜素的氧化是阻碍β-胡萝卜素含量提高的主要限制性因素。2)研究了双功能试剂甘油对三孢布拉氏霉产β-胡萝卜素的影响，当其添加量为3%时，β-胡萝卜素含量达到4.14 mg/g，较空白组提高了78.7%。可见其比单一效应的代谢调节剂有更好的促进作用。

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[责任编校： 张众]

Effect of Metabolic Regulator on β- Carotene Production by Blakeslea Trispora

YAN Xing, XIANG Mengxiong, WANG Changgao, DU Xin, LIN Jianguo, CAI Jun

(KeyLaboratoryofFermentationEngin.(MinistryofEducation),CollegeofBioengineering,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：Currently, problems such as low content of products, single metabolic regulation and so on exist in the fermentation production of β-carotene by Blakeslea trispora. In order to further improve the content of Blakeslea trispora’ s mycelium β-carotene, the present study added different metabolic regulators in the initial fermentation medium, exploring its impact on the β- carotene produced by Blakeslea trispora. The study found that fermentation medium added to 0.5% of pyruvic acid sodium, 0.1% of Span-20, 0.1% of butylated hydroxytoluene(BHT), 3% of glycerol can improve β- carotene content, which promote the greatest is antioxidant BHT, β- carotene content approach to 4.25mg/g, compared to the control group improved 72.1%. And different concentration of liquid paraffin could not increase β- carotene content, but the promotion of biomass production increases, so the production of β-carotene may be raised.

Keywords：Metabolic regulator; Blakeslea trispora; β- carotene

[中图分类号]Q815

[文献标识码]：A

[文章编号]1003-4684(2016)01-0085-04

[作者简介]闫兴(1993-)， 男， 湖北洪湖人，湖北工业大学本科生，研究方向为生物工程 蔡俊(1968-)，男，湖北孝感人，湖北工业大学教授，研究方向为微生物发酵工程

[基金项目]国家自然科学基金(31401807)

[收稿日期]2015-07-24