人表皮生长因子基因重组腺病毒穿梭质粒的构建和鉴定*

王巧稚，韩艺，邹礼乐，赵宏贤，梅欣明

（四川医科大学组织学与胚胎学教研室,四川泸州646000）

人表皮生长因子基因重组腺病毒穿梭质粒的构建和鉴定*

王巧稚，韩艺，邹礼乐，赵宏贤，梅欣明

（四川医科大学组织学与胚胎学教研室,四川泸州646000）

目的：构建含人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)基因的重组腺病毒穿梭质粒，为制备表达EGF基因的重组腺病毒奠定基础。方法:查找GenBank中hEGF的基因序列，通过化学方法进行全基因合成得到信号肽+hEGF基因片段，将sp-hEGF基因装载到pUC57质粒，双酶切后与经过同样处理的腺病毒穿梭质粒pYr-ads-6相连，即构建成pYr-ads-6-hEGF质粒，行双酶切及测序鉴定。结果：sp-hEGF成功插入腺病毒穿梭质粒pYr-ads-6中，测序鉴定与GenBank中的序列一致。结论：hEGF重组穿梭质粒构建成功。

hEGF，腺病毒，穿梭质粒，信号肽

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是一种小分子多肽，属于促生长因子家族成员之一[1]，最早由科恩博士在小鼠颌下腺中提取出，具有刺激细胞外透明质酸和糖蛋白分泌，以及细胞内DNA、蛋白质的合成，对上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等有较强的促增殖作用[2-3]。表皮生长因子具有明显的促进损伤修复的作用,但也有一些缺点：①创面坏死物或炎症因子会降低EGF对损伤细胞的修复效应。②生长因子无法在创面局部保持长期有效的浓度。③需多次使用，抬高治疗成本。如果能将hEGF基因导入脂肪干细胞,使转基因干细胞能持续分泌生长因子,再协同脂肪干细胞多向分化潜能，应该能提高创伤修复速度。因此，本实验旨在构造含人表皮因子基因的重组穿梭质粒，为创伤修复奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和试剂

pYr-ads-6腺病毒穿梭质粒购自湖南赢润生物技术有限公司。T4 DNA连接酶购自日本Takara公司，限制性内切酶均为MBI公司产品，Taq酶、dNTP、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及Buffer等均来自YRBIO公司，DNA Marker购自北京天根公司。pUC57质粒与DH5α菌株由医学实验中心实验室保存。

1.2 目的基因的合成

根据Gene Bank中已知Human cDNA EGF序列，获得hEGF cDNA全序列（NM_001963），选择合成EGF基因的信号肽（signal peptide,sp）片段（NM_001963,nt 453-nt 518)加hEGF基因分泌肽片段（NM_001963,nt 3363-nt 3521），sp-hEGF融合基因全长为234 bp，由南京金斯瑞生物科技公司用化学合成法行全基因合成。Sp-hEGF基因合成时，在上游5，端引入NheI酶切位点,下游3，端引入SalⅠ酶切位点。

1.3 克隆载体pUC 57-hEGF构建和鉴定

取sp-hEGF基因片段6 μL,T4DNA连接酶1 μL，pUC 57质粒（图1）1 μL，反应体系如下：Buffer缓冲液2.5 μL,ddH2O 14.5 μL,16℃恒温水浴过夜。取15 μL连接产物转化至感受态细胞DH5a[4]中，涂布在含氨苄的培养基上，37℃培养过夜，挑取较大白色菌落，扩增培养后提取质粒，并做NdeⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。

图1 pUC57质粒图谱

1.4 穿梭表达质粒pYr-ads-6-hEGF构建和鉴定

依次用限制性内切酶NdeI、SalI分别酶切克隆质粒pUC57-sp-hEGF和腺病毒穿梭质粒pYr-ads-6，将酶切后的sp-hEGF基因片段通过T4 DNA连接酶克隆到穿梭质粒pYr-ads-6上。反应体系为:缓冲液1.5 μL，载体DNA 1μL，目的基因DNA 7 μL,T4 DNA连接酶1 μL，ddH2O 4.5 μL。轻轻混匀后，16℃连接过夜，次日将混合液转化到感受态DH5a细胞，产物涂布于含卡那霉素的培养基上，37℃培养过夜。次日挑选平板上较大的白色菌落，在培养基中扩增。按质粒提取试剂盒说明，获得重组质粒pYr-ads-6-hEGF。限制性内切酶NdeI和SalⅠ双酶切重组质粒，挑选正确的阳性克隆，送南京金斯瑞生物科技公司测序。

2 结果

2.1 pUC57-hEGF质粒酶切鉴定

pUC57-hEGF质粒的阳性克隆经Hind III和NdeⅠ双酶切，切出2.4 Kb载体带和约540 bp含有sp-hEGF的小带（图2）。

图2 pUC57-hEGF质粒酶切图谱

2.2 pYr-ads-6-sp-hEGF质粒酶切鉴定

将sp-hEGF片段亚克隆至pYr-ads-6载体后，所获阳性克隆经NdeⅠ与SalⅠ进行酶切，可切出约650bp的小带和5.8Kb的大带。初步推测sp-hEGF基因片段已经克隆到pYr-ads-6载体。

图3 pYr-ads-6-hEGF质粒酶切图谱

图4 pYr-ads-6-hEG测序比对图

阳性克隆测序所得的序列和sp-hEGF基因片段进行比对，显示构建序列与预计碱基序列无差异，提示hEGF腺病毒穿梭质粒构建成功。

3 讨论

要想表达人表皮生长因子，转入原核质粒虽可获得大量重组蛋白，但原核质粒表达的重组蛋白缺乏相应的翻译后修饰，难以获得真正意义上的活性蛋白质。而在真核表达体系中，可通过信号肽引导分泌性蛋白质到达内质网，经修饰后，再经高尔基复合体囊泡运输可至胞外，从而发挥生物学效应[5-7]。可见蛋白质在向细胞外分泌的过程中，有赖于信号肽的介导[8]。多个研究证明，信号肽主要功能是调节蛋白前体折叠，引导蛋白质穿膜运转，对蛋白质的分泌有至关重要的作用[9-10]。

目前获取目的基因的方法主要有3种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法。人工化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法。我们通过检索NCBI GenBank数据库获取人cDNA EGF全基因序列为4875bp，全部用化学合成难度较大，且片段越大，成功转入质粒概率越小。为提高合成基因的成功率和降低后续插入载体的难度，选取hEGF信号肽加分泌肽基因片段，以使该融合基因在转染细胞后能更好的分泌生长因子。现有研究表明，在不更改氨基酸组成的条件下，DNA序列通过人工合成可提高蛋白表达量[11]。基因化学合成虽然不像PCR那样能实现迅速高效的扩增，但却有着不需要模板，直接面向序列等无法替代的优势，可大大缩短制备目的基因的时间[12]。

后续实验中，拟将pYr-ads-6-hEGF质粒进一步做腺病毒包被，并感染脂肪干细胞，用于全层皮损的修复研究，考虑到到干细胞不易被转染的特点，选择了腺病毒穿梭质粒作为hEGF表达载体。因腺病毒载体宿主范围广，可感染分裂和非分裂细胞、转染效率高、病毒滴度浓度可控、外源基因装载容量大等优点，已成为基因治疗研究中常用的转基因载体[13-14]。本实验中选择的pYr-ads-6质粒带有绿色荧光蛋白（GFP）基因，其示踪作用有助于在后续试验中，更好地了解目的基因在转染细胞中的位置、扩散范围和作用时相[15]。

pUC57-hEGF质粒若采用克隆位点NheI和SalⅠ酶切，应会切出约250 bp的目的基因片段带和2.7 Kb的大带。但因250 bp片段条带不明显，故换用质粒上的Hind III和NdeⅠ进行酶切，得到540 bp小带与预测相符。最终将重组穿梭质粒pYr-ads-6-hEGF双酶切后，切出约650 bp的小带和5.8 Kb的载体带。所获目的片段均与预期相符，初步确定了重组体的正确。进一步通过基因测序将sp-hEGF基因序列与Gen-Bank所公布序列行碱基对比分析，两者一致，证明pYr-ads-6-hEGF腺病毒穿梭质粒构建成功。

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（2015-10-10收稿）

Constructionandidentificationofarecombinantadenoviralshuttleplasmid expressinghEGFgene

Wang Qiaozhi,Han Yi,Zhou Lile,Zhao Hongxian,Mei Xingming
Department of Histology and Embryology,Sichuan Medical University，Luzhou 646000,SichuanProvince,China

Objective：To construct a recombinant adenoviral shuttle plasmid expressing hEGF gene to deliver hEGF gene effectively.Methods：sp-hEGF cDNA based on the GenBank was chemically synthesized and inserted into the plasmid puc57.The plasmid was digested with NdeI and HindIII,and the double-digested fragment was then cloned into adenoviral shuttle plasmid pYr-ads-6,forming pYr-ads-6-sp-hEGF.The recombinant adenoviral plasmid was verified by double digestion and DNA sequencing.Results：sp-hEGF was successfully synthesized and cloned into adenoviral shuttle plasmid pYr-ads-6.Conclusion：The recombinant adenoviral plasmid carrying hEGF gene is successfully constructed.

hEGF;Adenovirus;Shuttle plasmid；Signal peptide

R329；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.007

*四川省卫生厅科研项目（NO:90192）

王巧稚(1978-），女，副教授。E-mail：wqz416@163.com