闽西地区猪伪狂犬病病毒变异株gC基因克隆与序列分析

范克伟，戴爱玲，李晓华，吴德峰，闫娜娜，江丹丹，杨小燕（.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩6402；2.福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩6402；.福建农林大学动物科学学院，福建福州50002）



闽西地区猪伪狂犬病病毒变异株gC基因克隆与序列分析

范克伟1，2，戴爱玲1，2，李晓华1，2，吴德峰3，闫娜娜1，江丹丹1，杨小燕1，2
（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；2.福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩364012；3.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

摘要：为了解闽西地区2013年以来猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律，收集了闽西不同地区的14株PRV分离株，并对其gC基因进行遗传变异分析。结果表明，14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的核苷酸序列同源性为98.8%～99.7%，而与Bartha疫苗株核苷酸序列同源性为93.6%～93.8%。氨基酸多序列比对发现，14株PRV分离株和近年来国内分离的PRV毒株gC基因氨基酸序列同源性较高，有很多相同的特征性氨基酸替换，其中最有特征性的是aa52～aa61，aa63～aa69位和aa186～aa194位氨基酸的替换和插入。遗传进化树分析表明，14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV株位于一个相对独立的大分支中，且形成了一个独立的亚分支，而与Bartha疫苗株存在很大差异，亲缘关系较远。抗原表位预测分析表明，PRV闽西分离株与Bartha疫苗株相比发生了抗原漂移，该差异是否预示闽西地区流行株正在向远离疫苗株的方向变异尚有待进一步研究。

关键词：猪伪狂犬病病毒；gC基因；序列分析

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性传染病，以新生仔猪的腹泻及神经症状，妊娠母猪繁殖障碍、流产、死胎及呼吸道症状，成年猪隐形感染，长期带毒排毒为特征。在我国猪伪狂犬病的流行范围很广，给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟。PRV属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科，基因组为双链DNA，全长约150 kb，基因组GC含量最高达73%，至少含有70个基因，编码约100种蛋白质，成熟的病毒粒子约含有50种蛋白质[1]。gC是PRV的一种重要的糖蛋白，虽然gC不是PRV复制所必需的，但作为PRV最主要的保护性抗原之一，它不仅能诱导细胞免疫，产生中和抗体，还能与猪的补体C3结合，激活补体系统，从而在防御系统中起作用。另一方面，gC在病毒对靶细胞的吸附，传播中的释放，以及影响病毒毒力方面也起着十分重要的作用[2-3]。2012年以来，在我国河北、河南、山东等多个省份的猪伪狂犬基因缺失疫苗免疫猪场发生猪伪狂犬病的流行，发病率和死亡率明显上升，且出现了新的发病特征，给我国养猪业造成了重大的经济损失[4-6]。已有研究表明，与以前的流行株相比，新流行株的抗原性已发生变异，从而导致现有疫苗不足以提供完全保护，同时发现PRV变异株gC基因存在抗原漂移现象，并且在从不同地区获得的PRV分离株之间更明显[3、7]。因此，为进一步了解闽西地区PRV流行毒株之间gC基因的变异情况，本研究对2013-2014年闽西地区PRV分离株gC基因进行序列分析，以期分析阐明该地区PRV流行株的分子特征，为猪伪狂犬病的有效防控提供科学依据。

1　材料与方法

1.1细胞和病毒样品Vero细胞由本实验室保存；2013-2014年采集龙岩学院动物医学研究所接诊病例中临床症状疑似为PRV感染猪的脑组织。将经PCR鉴定为PRV阳性的脑组织研磨、离心、过滤后，接种于Vero细胞培养，观察有无细胞病变。将引起细胞病变的病毒株传2-3代后用于PRV gC全基因扩增。

1.2主要试剂DMEM，购自Gbico公司；胎牛血清，购自杭州四季青生物有限公司；DL-2 000 DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、Universal Genomic DNA Extraction Kit、pMD18-T克隆载体，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3引物设计根据GenBank中登录的PRV全基因组序列（NC_006151）设计并合成了用于gC全基因扩增和序列分析的引物，gC-F：5′-ATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTC-3′，gC-R：5′-TCACGGCCCCGCCCGGCGGTAGTAGACG-3′，扩增片段大小1 440 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4病毒DNA的提取及PCR鉴定根据TaKaRa公司Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒说明书提取PRV DNA，利用上述引物扩增PRV gC基因全序列。PCR反应体系总体积25 μL：DNA模板2 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，LA Taq酶0.25 μL，用ddH2O补至25 μL。PCR程序：94℃5 min；94℃1 min，53℃50 s，72℃2 min，35个循环；72℃10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5gC基因的克隆与序列分析将目的基因经胶回收后克隆至pMD18-T载体中，送Invitrogen公司进行序列测定，每个样品选择3个克隆，每个克隆测序3次。利用生物信息软件对14株PRV分离毒株与GenBank中登录的其他PRV毒株的gC基因序列进行比对，分析分离毒株的序列特征。

2　结果

2.1gC基因PCR扩增结果14株PRV分离株通过PCR扩增后，凝胶电泳结果显示，获得了与预期大小相一致的约1 440 bp的扩增条带（图1）。

图1　PRV闽西分离株gC基因全序列PCR扩增结果M：DNA分子质量标准；1～14：FJLY01～14 gC基因PCR产物

2.2gC基因序列分析将回收的PCR产物连接于pMD18-T载体中送Invitrogen公司测序，将测序结果与GenBank中登录的其他21株PRV gC基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对，结果表明，14株PRV分离株的gC基因核苷酸序列与2012年以来国内不同省份陆续分离的TJ、SDWF1、LGX等PRV变异株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～99.7%和97.7%～99.4%；而与Bartha、Becker、Ea等经典株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.6%～99.4%和91.2%～98.8%，说明它们与2012年以来国内不同省份陆续分离的PRV变异株核苷酸及氨基酸同源性较高，与Bartha、Ea等经典株的同源性相对较低，其中与Bartha疫苗株的核苷酸和氨基酸同源性最低分别为93.6%～93.8%和91.2%～91.7%。

核苷酸多序列比对结果显示，14株PRV分离株和国内不同时期分离的PRV株gC基因核苷酸序列中有很多点突变一致，尤其是与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株核苷酸突变位点的一致性最高，且分布比较集中，主要为30～111 bp，128～181 bp，210～227 bp，250～352 bp，558～581 bp，699～728 bp，1 381～1 407 bp及1 451～1 460 bp。此外，gC基因区域还存在一个高变区，位于210～227 bp，此部位存在大量的G-C碱基替换。最具有特征性的是在175～179 bp的碱基序列CCCGA突变为GGGAC以及186～206 bp国内近几年分离的PRV分离株均存在一段21个碱基的连续插入。虽然部分经典株（Fa、Ea、P-Prv）在这个位置也有21个碱基的连续插入，但2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株在此位点却高度一致。另外，值得注意的是在gC基因核苷酸序列150 bp处，14株PRV分离株出现了一致性的碱基突变（G→A），而21株参考毒株中只有2013年分离的BJRD株（KF017273）在此位点发生了一致性碱基突变。氨基酸多序列比对发现，14株PRV分离株和11株PRV国内分离株gC基因氨基酸序列同源性较高，有很多相同的特征性氨基酸替换，其中最有特征性的是第aa52～aa 61，aa 63～aa 69和aa 186～aa 194位氨基酸的替换和插入。这些特征性的变异可能会导致PRV分离株和Bartha疫苗株之间的抗原性发生一定的改变。

2.3gC基因的遗传进化树分析为了进一步了解闽西地区PRV分离株的遗传学特性及相互的亲缘关系，将14株PRV分离株与GenBank中登录的其他21株国内外PRV分离株的gC氨基酸序列进行遗传进化树分析，结果显示，14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份陆续分离的PRV变异株位于一个相对独立的大分支中，但14株分离株又形成了一个独立的亚分支，表明14株PRV分离株虽然属于近年来流行的PRV变异毒株，但与国内其他地区分离的PRV毒株之间仍存在一定的差异（图2）。此外，国内经典毒株Ea、Fa及马来西亚P-Prv株也处于近年来流行的PRV变异毒株形成的同一个大分支中，其中Ea株与2012年以来国内不同省份陆续分离的PRV变异株处于一个独立的亚分支中，说明近年来流行的PRV变异毒株与Ea株的亲缘关系最近。而与Bartha疫苗株位于不同的大分支中亲缘关系较远，表明现行的Bartha疫苗株已不能对PRV变异毒株提供完全的免疫保护。

2.4PRV闽西地区分离株与Bartha株gC蛋白抗原性及表面抗原位点的差异分析选择14株分离株中与Bartha株氨基酸同源性最低的PRV FJLY11株为闽西地区PRV分离株的代表毒株，应用DNAStar软件对FJLY11株和Bartha疫苗株进行gC蛋白抗原性及表面抗原位点对比分析，结果表明，FJLY11株与Bartha疫苗株gC蛋白抗原指数之间存在差异，主要体现在氨基酸50～130位，180～190位，320～330位，如前插彩版图3箭头所示。FJLY11株gC蛋白的抗原表位与Bartha疫苗株相比发生了漂移，这可能是近年来导致福建省猪伪狂犬疫苗免疫失败的主要原因之一。

图2　PRV闽西分离株与参考毒株gC氨基酸序列系统进化分析

3　讨论

gC是PRV最主要的保护性抗原之一，它不仅能诱导细胞免疫，产生中和抗体，还能与猪的补体C3结合，激活补体系统，从而在防御系统中起作用。另一方面，gC在病毒对靶细胞的吸附，传播中的释放，以及影响病毒毒力方面也起着十分重要的作用[2-3]。因此，分析流行毒株的gC基因，了解其抗原变异性，对于研究PRV多样性及其分子进化具有重要意义，有助于在分子水平上揭示规模化猪场伪狂犬病的存在和发生原因。

本研究对闽西地区PRV分离株gC基因序列分析结果表明，14株PRV分离株与参考毒株的gC基因序列核苷酸和氨基酸同源性分别为93.6%～99.7%和91.2%～99.4%，同源性较高，具有较高的保守性。但核苷酸多序列比对结果发现，不同PRV毒株间gC基因核苷酸序列中仍存在一些差异。其中14株PRV分离株在核苷酸150位均出现了一致性的碱基突变（G→A，未引起氨基酸变化），表明该突变可能是当前闽西地区PRV流行株特有的分子特征。此外，14株PRV分离株与参考毒株gC基因核苷酸序列中有很多点突变一致，尤其是与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株gC基因核苷酸突变位点的一致性最高，且分布比较集中。主要表现在高突变区碱基变化、175～179位碱基序列突变以及186～206位21个碱基的连续插入，这些突变造成相应区域氨基酸的变化，进而致使不同地区分离的PRV毒株gC基因氨基酸序列存在较大差异。另外，本研究发现，不同PRV毒株gC蛋白氨基酸的38处突变都发生在第162位氨基酸前的区段内，占总变异数的50%，与前人研究结果一致[2]。有研究表明，gC基因的前1/3段是主要的功能区[8]，这些突变是否会影响PRV的功能，是否会造成抗原漂移呢？

遗传进化树分析结果显示，14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株处于一个相对独立的大分支中亲缘关系最近，属于近年来流行的PRV变异毒株，表明PRV变异毒株已成为闽西地区主要的流行毒株。与Bartha疫苗株亲缘关系较远处于不同的遗传分支中。gC蛋白抗原性分析表明，FJLY11株与Bartha株的gC蛋白抗原指数之间存在差异，发生了漂移。这些结果都表明闽西地区PRV分离株正在向远离疫苗株的方向变异，现行的猪伪狂犬疫苗株Bartha株虽然能起到一定的保护作用，但不能提供完全的免疫保护，这可能是导致闽西地区部分猪场猪伪狂犬病暴发的原因之一。

参考文献：

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[8] Trybala E，Bergstrom T，Spillmann D，et al . Interaction between Pseudorabies Virus and Heparin/Heparan Sulfate[J].Journal of Biological Chemistry，1998，273（9）：5047-5052.

通讯作者：杨小燕，E-mail：lyyxy1988@126.com

作者简介：范克伟（1983-），男，讲师，博士，主要从事分子病原学与免疫学研究，E-mail：fankewei8399@163.com

基金项目：福建省农业科技重大专项项目（2014NZ01060015）；福建省教育厅资助省属高校项目（JK2013052）

收稿日期：2015-04-09

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0047- 03