不同剂量生白术对慢传输型便秘大鼠胃肠道传输功能及Cajal间质细胞的影响

王文革，次苗苗，张俊红，刘　兴

(1.中国人民解放军空军总医院儿科，北京100142;2.北京市大兴区红星医院儿科，北京 100076)



不同剂量生白术对慢传输型便秘大鼠胃肠道传输功能及Cajal间质细胞的影响

王文革1，次苗苗1，张俊红1，刘兴2

(1.中国人民解放军空军总医院儿科，北京100142;2.北京市大兴区红星医院儿科，北京 100076)

摘要：目的比较不同剂量生白术对慢传输型便秘大鼠(STC)胃肠道传输功能及Cajal间质细胞(ICC)的影响。方法Wistar大鼠40只，分为空白对照组、模型组、常规剂量生白术组、大剂量生白术组。空白对照组及模型组给予生理盐水灌胃,其余各组均给予相应药物灌胃治疗，14 d后采用营养性半固体糊灌胃法测定各组大鼠胃残留率、黑色炭末推进率，并采用免疫组化法观察各组大鼠胃窦、小肠、结肠组织ICC细胞数量及形态的变化。结果常规剂量生白术组、大剂量生白术组与模型组比较，胃残留率明显降低(P<0．05)，而二者之间比较无统计学意义(P>0．05)。常规剂量生白术组、大剂量生白术组均可增加黑色炭末推进率(P<0．05)，其中大剂量生白术效果优于常规剂量生白术(P<0．05)。常规剂量生白术组、大剂量生白术组均可增加c-kit阳性细胞的面积(P<0．05),而大剂量生白术优于常规剂量生白术(P<0．05)。结论生白术常规剂量及大剂量均可促进慢传输型便秘大鼠的胃动力,而在改善其肠道传输功能及增加c-kit阳性细胞面积方面则以大剂量白术效果为佳。

关键词：生白术；慢传输型便秘；胃肠动力；Cajal间质细胞

慢传输型便秘(slow-transit constipation,STC)是一种以结肠通过时间延长和结肠动力下降为特征的顽固性便秘,是慢性便秘中常见的类型，好发于儿童、妇女和老人，不仅严重影响患者的生活质量，还给家庭及社会带来了沉重的经济负担[1-2]。近年来，随着人们饮食结构、生活习惯以及精神心理等因素的影响，其发病率呈逐年上升趋势，而临床对STC的治疗一直不能取得满意疗效，目前患者对慢性便秘治疗的满意度低于50%[3-4]。STC治疗困难的主要原因是其发病原因不明，发病机制尚不确切。Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal,ICC)是肠神经系统的一种具有独立功能的特殊类型的细胞,以网状结构存在于胃肠道[5]。由于其在控制胃肠动力方面独特和重要的地位,已逐渐成为胃肠动力领域的研究热点之一。近年来研究[6-7]表明，ICC的数量减少、分布、结构及功能异常，是STC的发病机制中的关键因素。白术是传统的补气药，有健脾燥湿之功，常用于脾虚泄泻，较少专用于通便。而单用大剂量生白术则可治疗慢性便秘，近10年来验之临床，疗效颇佳[8-9]。不同剂量白术为何有不同的临床疗效，其作用机制如何，有待进一步的实验加以揭示。本实验采用胃残留率及黑色炭末推进率测定以检测大鼠的肠道传输功能，研究不同剂量生白术对STC大鼠胃肠道传输功能的影响；并采用免疫组化法，观察白术对STC大鼠胃窦、小肠、结肠组织ICC细胞数量及形态的影响,以期探讨不同剂量生白术对STC的作用机制。

1材料

1.1实验动物健康Wistar大鼠40只，清洁级，均为雄性，周龄4～5周，体质量50～80 g，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2011-0004。

1.2主要试剂大黄酸粉(南京泽朗医药技术有限公司，批号:ZL20130310A)；生理盐水(湖南康源制药有限公司)。粉末活性炭(分析纯)(国药集团化学试剂有限公司)；生白术水煎剂：生白术饮片(北京同仁堂药店)，将生白术用蒸馏水浸泡12 h后高火煎煮20 min, 倒出煎液，12层纱布过滤，重复2次，合并3次滤液，浓缩为1.75、7.0 g/mL药液，按生白术临床治疗便秘大剂量60 g/d，常规剂量15 g/d，换算配制水提物溶液。营养性半固体糊的制备[10-11]： 取10 g羧甲基纤维素钠，溶于250 mL蒸馏水中，分别加入16 g奶粉，8 g糖,8 g淀粉和2 g活性炭末,搅拌均匀，配制成300 mL约300 g的黑色半固体糊状物，冰箱冷藏,用时恢复至室温。制备后营养性半固体糊密度为1 g /mL。

1.3主要仪器Termo烤片仪(英国)；RM2235石蜡切片机(德国LEICA公司)；RM2145组织切片机(美国Leica公司)；DH3600 A电热恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限有限公司) ECLIPSE801生物显微镜(日本Nikon公司)；数码相机(日本Olympus公司)；ANTI-MOULD型显微镜摄像系统(日本Nikon公司)。4 ℃冰箱(美菱冰箱厂)；微量可移液器(美国Gilson公司)；c-kit兔抗鼠多克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)；兔/鼠两步法试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)。

2方法

2.1STC大鼠模型制备参照张波等[12]的造模方法,采用大黄酸粉悬液灌胃法建立STC大鼠模型。大鼠分笼饲养，保持适宜的环境，饲养7 d后开始建立模型。对照组给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃。各治疗组、模型组给予大黄酸粉悬液灌胃，造模过程分3个循环完成。第1循环约35 d，给药剂量为240 mg/(kg·d)，灌2 d停1 d，灌胃第2天半数大鼠出现稀便，维持此剂量至80%大鼠稀便消失后开始下一循环；第2循环约35 d，给药剂量同上，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；第3循环约45 d，给药剂量为320 mg/(kg·d)，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失；3个循环共约115 d。

2.2动物分组及处理按照完全随机的方法，将40只大鼠完全随机分为空白对照组、模型组、常规剂量生白术组、大剂量生白术组，每组10只，分组后各组体质量无显著性差异。模型建立后，空白对照组、模型组给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃。常规剂量生白术组、大剂量生白术组分别给予生白术水煎剂，1.75、7.0 g/(kg·d)给大鼠灌胃[3-4]，2次/d，共14 d，每天观察大鼠的精神状态、皮毛色泽，活动范围，进食、饮水量及大便性状。整个过程结束普通干饲料饲养待处理。

2.3观察指标及方法

2.3.1胃残留率及黑色炭末推进率测定治疗结束7 d后大鼠禁食，不禁水24 h，各组大鼠经口灌入营养性半固体糊2 mL，40 min后以颈椎脱臼法处死，立即剖腹，结扎幽门与贲门和直肠末端，取出全胃，幽门至直肠末段的全部肠管，清洗胃表面，测得胃总重(W1)后，沿胃大弯剖开，洗去胃内容物，用滤纸吸干水分测得胃净重(W2)，并计算胃残留率。无张力情况下测量肠道全长(L1)及黑色营养性半固体糊在肠道内推进的长度(L2)，并计算黑色炭末推进长度占肠道全长的百分比，最后计算每组的平均值。胃残留率(%)=(W1-W2)/糊重×100%。黑色炭末推进率(%)=(L2/ L1)×100%。

2.3.2标本采集胃称重后，留取胃窦部胃壁全层，约0.5 cm×0.5 cm大小。同时十二指肠远端、结肠(直、乙状结肠)各留取长约1 cm的肠管组织，纵行剖开，生理盐水冲洗，分别固定于多聚甲醛溶液中，常规脱水，石蜡包埋。

2.3.3HE染色片制备和观察石蜡切片后常规脱蜡脱水，苏木素染色液中染色5 min，自来水洗，温水蓝化，自来水冲洗，伊红染色液染色2 min，80%乙醇适当分化，95%、无水乙醇分别脱水2次，二甲苯透明1 min，中性树胶封片。

2.3.4免疫组化染色石蜡切片经常规脱蜡脱水，PBS冲洗，抗原修复(采用高温高压修复时间为100 s)，PBS冲洗，过氧化氢溶液37 ℃孵育10 min，PBS冲洗，滴加适量一抗(1∶00)在37 ℃湿盒内孵育60 min，PBS冲洗，滴加二抗，室温下孵育40 min，水洗，PBS冲洗，滴加DAB显色液，清水冲洗，苏木精染色，中性树胶封片。

3结果

3.1一般情况造模时间为115 d，造模后，大鼠出现皮毛发红、无光泽，精神萎靡，活动量减少，进食少，形体消瘦，体质量平均下降约20%，饮水量明显增多。大部分大鼠在饲喂过程中出现血便，半数大鼠出现血尿，3只大鼠在饲养过程中出现脱肛。经生白术灌胃后，大鼠上述情况有所好转。

3.2各组大鼠胃残留率比较见表1。

组 别胃残留量/g胃残留率/%空白对照组 0.73±0.1936.30±9.57 模型组 1.47±0.2272.74±8.94#常规剂量白术组0.84±0.1841.75±9.16△大剂量白术组 0.91±0.1945.65±9.31△

注：与空白对照组比较，#P<0．05，与模型组比较△P<0．05

3.3各组大鼠黑色炭末推进率比较见表2。

组 别肠道全长/cm黑色炭末推进长度/cm黑色炭末推进率/%空白对照组 133.07±6.2782.35±6.5861.84±3.05 模型组 135.66±4.3353.23±6.6339.24±4.28# 常规剂量白术组132.07±7.6469.51±8.0052.13±4.37△ 大剂量生白术组135.62±5.8576.90±6.5656.76±5.16△▲

注：与空白对照组比较，#P<0．05，与模型组比较，△P<0．05，与常规剂量白术组比较，▲P<0．05

3.4胃肠道大体形态和苏木精-伊红染色观察模型组大鼠胃黏膜层略薄于空白对照组，治疗后2组胃黏膜层均有所改善。模型组大鼠小肠黏膜层绒毛与空白对照组相比明显变短、减少，经常规剂量生白术组、大剂量生白术组治疗后，大鼠小肠绒毛形态有所改善，而大剂量生白术较常规剂量生白术效果更明显。模型组大鼠小肠黏膜层可见少量淋巴细胞为主的炎细胞浸润，偶有上皮细胞脱落，但未见明显溃疡。结肠可见慢性炎症，全层均有嗜酸性粒细胞浸润，以固有层为主，但未见明显的溃疡。经常规剂量生白术组、大剂量生白术组治疗后，小肠、结肠黏膜层炎细胞均有减少。模型组大鼠结肠较空白对照组粗大、迂曲，肠腔内可见大块粪便存留。经常规剂量及大剂量生白术治疗后，结肠肠腔内均未见大块粪便存留，而大剂量白术组效果更为明显。

3.5各组大鼠胃肠道中c-kit阳性细胞分布变化比较见表3。

组 别胃小肠结肠空白对照组 35882.00±6519.1042780.43±3819.76 44169.71±5353.43 模型组 33631.57±4473.5318683.86±3431.47#16305.86±5454.73# 常规剂量白术组34035.82±2729.0720542.19±5218.42 25416.57±4621.28△ 大剂量生白术组33998.26±4375.3121067.81±5265.07 32980.11±4019.01△▲

注：与空白对照组比较，#P<0．05;与模型组比较，△P<0．05;与常规剂量白术组比较，▲P<0．05

4讨论

白术性温，归脾、胃经，其功能主要在于健脾益气，燥湿利水，用于脾虚食少，腹胀泄泻。临床较少专用之治疗便秘。1978年北京医院的魏龙骤[13]先生首先介绍了重用生白术治便秘的临床经验，之后的30余年来，大剂量生白术治疗便秘已在临床广泛使用,且疗效肯定。但对不同剂量白术治疗便秘的作用机制有何不同，其量效关系如何，相关的实验研究还较少。

临床上慢传输型便秘患者除便秘之外，往往还有脾虚气亏之表现，如腹胀、纳差、乏力等。根据慢传输型便秘的临床表现，笔者认为其可归属于中医虚秘、气秘范畴。肠道传输缓慢即脾胃运化传输能力减弱，故其病位虽在大肠，但与脾虚气亏有着密切关系。本实验显示STC大鼠在黑色炭末推进率明显降低的同时，其胃残留率明显增加，经常规剂量及大剂量白术治疗后胃残留率均有所下降，而二者之间无显著差异。对于黑色炭末推进率的降低，小肠黏膜层绒毛的改善、结肠肠腔内粪块的排出以及结肠c-kit阳性细胞的面积增加等方面，大剂量生白术的疗效均明显优于常规剂量生白术。说明生白术常规剂量及大剂量均可以促进STC大鼠的胃动力，而在改善STC大鼠肠道传输功能及增加c-kit阳性细胞面积方面则以大剂量白术效果为佳。

作为胃肠道的起搏细胞,Cajal间质细胞(ICC)在控制胃肠道运动中起重要作用，目前公认其在结肠中的数量和结构异常与STC发病有密切的关系。Cajal间质细胞(ICC)的标记方法有多种，而特异性最强的是c-kit。c-kit信号在维持ICC的发育、发展、功能方面具有重要作用，去除大鼠小肠c-kit基因后，ICC将不能产生慢波，从而导致胃肠运动功能紊乱[14]，因此现在常用c-kit免疫组织化学法特异性地检测ICC[15]，利用c-kit免疫组织化学法可在光镜水平观察ICC形态、数量和分布特点[16]。本实验表明STC大鼠胃窦、小肠、结肠c-kit阳性细胞数目无明显变化，其胃窦肌层c-kit阳性细胞面积也无明显变化，而STC大鼠小肠、结肠组织c-kit阳性细胞的面积则明显降低，其更深层次的机制，还需要进一步的实验加以阐明。

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AtractylodesmacrocephalaKoidzon gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation

WANG Wenge1,CI Miaomiao1,ZHANG Junhong1,LIU Xing2

(1.Department of Pediatrics,Air Force General Hospital of People’s Liberation Army,Beijing 100142,China;2.Department of Pediatrics,Hongxing Hospital of Daxing District,Beijing 100076,China)

Abstract：Objective To observe the influence of Atractylodes macrocephala Koidz on gastrointestinal trace and ICC in rat with slow transit constipation.MethodsThe 40 Wistar rats were randomly divided into blank control group,model group,Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group,Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group.The blank control and model group were given normal saline by gavage,the rest of the groups were given drug treatment accordingly.After 14 days,gastric motility and transit functions of intestinal movement were examined by administering intragastricly of semi-solid nutrition paste.The ICC changes in terms of the number and volume were observed by immunohistochemical method.ResultsAtractylodes macrocephala Koidz treatment group compared with model group can significantly reduce the gastric residual rate ( P< 0．05),but there was no significant difference with each other(P>0．05).Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can increase the carbon black transit rate (P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group were significantly higher than in the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose t group( P< 0．05).After treatment by Atractylodes macrocephala Koidz, the volume of c-kit positive cell in colon were increased(P< 0．05),and Atractylodes macrocephala Koidz high-dose group was more larger than the Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose group(P< 0．05).ConclusionThe Atractylodes macrocephala Koidz normal-dose and high-dose group can promote the gastrointestinal motility,Atractylodes macrocephala Koidz of high-dose has the better effect on transit function of intestinal movement and the volume recovery of ICC in colon.

Keywords：Atractylodes macrocephala Koidz;slow transit constipation;gastrointestinal motility;interstitial cell of Cajal

(收稿日期:2015-06-11)

文章编号：2095-6258(2016)01-0018-04

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

作者简介:王文革(1966-)，女，博士研究生，副主任医师，主要从事中西医结合儿科疾病研究。

基金项目:北京市自然科学基金项目(7122180)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.006