黄芩苷联合氟康唑通过降低c AMP抑制白念珠菌酵母-菌丝形态转化

冯鑫 施高翔 云云 吴大强 邵菁 汪天明 汪长中(安徽中医药大学中西医结合临床学院安徽省中医药科学院中西医结合研究所,合肥230038)



黄芩苷联合氟康唑通过降低c AMP抑制白念珠菌酵母-菌丝形态转化

冯鑫 施高翔 云云 吴大强 邵菁 汪天明 汪长中
(安徽中医药大学中西医结合临床学院安徽省中医药科学院中西医结合研究所,合肥230038)

【摘要】目的 探讨中药有效成分黄芩苷(Baicalin,BA)联合氟康唑(Fluconazole,FLC)对白念珠菌(Candida albicans)形态转化的影响及机制。方法 在菌丝诱导培养基(液体和固体培养基)上观察两药联用对白念珠菌酵母-菌丝形态转化的影响;ELISA法检测两药联用对胞内c AMP含量的影响;回补实验验证两药联用对胞内c AMP的影响;qRT-PCR检测两药联用对白念珠菌c AMP相关基因RAS1,CDC35和PDE2表达的影响。结果 黄芩苷联合氟康唑能显著抑制白念珠菌酵母-菌丝形态转化,降低胞内c AMP水平;外源性c AMP能逆转两药联用所造成的菌丝抑制;两药联用使RAS1和CDC35表达分别下调35%和27%,使PDE2上调1.21倍。结论 黄芩苷协同氟康唑显著抑制白念珠菌形态转化,其作用机制可能与下调胞内c AMP有关。

【关键词】白念珠菌;黄芩苷;氟康唑;形态转化;c AMP

[Chin J Mycol,2016,11(1):8-12]

近年来,随着免疫力下降人群的不断增加,深部真菌感染率大幅上升。据不完全统计,重症监护室内白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)感染诱发的死亡率高达30%～60%[1]。白念珠菌为酵母-菌丝双相性真菌,当酵母相定植于黏膜组织表面后,可通过形态转化形成菌丝,侵袭宿主细胞对其造成损害,甚至引起严重的深部真菌感染[2]。同时,菌丝也参与白念珠菌生物膜的形成,而生物膜的形成将极大提高菌体的致病性和耐药性。故能否抑制白念珠菌酵母-菌丝的形态转化是防治白念珠菌感染的关键。目前,临床可供选择的抗真菌药物有限,除了研发新药外,新的抗真菌策略之一即是通过天然化合物(尤其是植物药)与临床常用抗真菌药物联用,达到减毒增效的功效。中药具有资源丰富、副作用小、价格低廉、药效综合等特点,在我国广泛用于临床疾病的治疗。黄芩苷(Baicalin,BA)是从双子叶植物黄芩的干燥根中提取的黄酮类化合物,药理作用广泛[3],近年来发现该药本身虽有一定的抗真菌作用[4-5],当其与氟康唑联用时可发挥显著的协同抗真菌效应[6]。在此基础上,本研究拟进一步探讨黄芩苷联用氟康唑对白念珠菌重要毒力因子之一的酵母-菌丝形态转化的影响及可能的分子机制,旨在为中西药联合治疗由白念珠菌引起的真菌感染提供重要的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌SC5314,由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。

药物 氟康唑(Fluconazole,FLC,批号100314-201204)购自中国食品药品检定研究院;黄芩苷(纯度＞98%,批号XC20140301),购于西安小草植物科技有限公司。

试剂 PBS缓冲液(p H7.0±2.0,实验室配制);25%戊二醛溶液(国药集团化学试剂有限公司);DMSO(博美生物科技有限公司);Total RNA提取试剂(TOYOBO);PCR试剂(TOYOBO); RPMI-1640培养基(Life technologies公司)。

仪器 96孔细胞培养板(Nunclon丹麦公司);恒温培养箱(上海博迅实业公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司);Spectra Max M2e多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司);CX21型光学显微镜(OLYMPUS);7700型荧光定量PCR 仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

菌悬液的配制 实验前,从4℃保存的沙氏培养平板上用接种环挑取单菌落C.albicans SC5314,接种至酵母蛋白胨培养液,37℃活化过夜,使其处于指数生长期,以RPMI-1640培养基调整菌液浓度至2×103CFU/m L和2×106CFU/ m L备用。

分组 本实验各指标检测均为4个组别:空白对照组、黄芩苷单用组(62.5μg/m L)、氟康唑单用组(0.125μg/m L),两药联用组(黄芩苷62.5μg/ m L+氟康唑0.125μg/m L)。

液体培养基中的白念珠菌酵母-菌丝转化实验[7-8]将过夜活化的C.albicans SC5314菌悬液以含血清YPD液体培养基调整浓度至2×105CFU/m L,加入新的96孔板中,分别加入黄芩苷、氟康唑以及黄芩苷+氟康唑,并设空白对照组。37℃静置培养3、6、9 h,以倒置显微镜观察菌体形态并拍照。实验重复3次。

固体平板中的白念珠菌酵母-菌丝转化实验将过夜活化的C.albicans SC5314菌悬液浓度调整至2×103CFU/m L,取50μL菌液,分别均匀涂抹于含黄芩苷、氟康唑以及黄芩苷+氟康唑的含血清YPD琼脂平板上,并设空白对照组。置于37℃条件下培养,5～7 d后以显微镜观察长出的菌落并拍照。实验重复3次。

胞内c AMP含量测定 将C.albicans SC5314菌浓度调整至2×105CFU/m L,接种于RPMI-1640培养基中,分别加入黄芩苷、氟康唑以及黄芩苷+氟康唑,并设空白对照组。37℃培养8 h后,离心收集细胞。c AMP的提取方法:复融冷冻的细胞,用冰冷的水清洗1遍并复融,一半的悬液用来干燥并称重,另一半转移至2 m L离心管中,4℃低温条件下进行破碎,10 min后低温10 000 r/min离心15 min。上清以水饱和醚中和五次,待检测时以500μL c AMP检测试剂重悬,按c AMP ELISA试剂盒说明对样品进行检测。

外源c AMP回补实验[9]将白念珠菌SC5314浓度调整至2×105CFU/m L,分为2组,一组加入黄芩苷(62.5μg/m L)+氟康唑(0.125μg/m L),一组加入黄芩苷(62.5μg/m L)+氟康唑(0.125 μg/m L)+5 mmol/L二丁酰环腺苷酸(dibutyrylc AMP,dbc AMP),以加入相同体积的溶剂作为空白对照或者终浓度为5 mmol/L dbc AMP作为阴性对照。37℃培养24 h后用显微镜观察不同处理组中白念珠菌的菌体形态变化。

实时荧光定量PCR[10]①总RNA的提取及逆转录:黄芩苷与氟康唑联合作用C.albicans SC5314后,离心收集菌体后进行总RNA提取。逆转录反应条件:6μL RNA预变性(65℃5 min, 4℃1 min),加入2μL的DNA Master(含gDNA Remover),5RT-Master Mix II(2μL),混匀后按如下条件进行反转录:50℃5 min→98℃5 min→4℃1 min。②引物设计与合成:从NCBI基因库中查得所需基因序列,并用Oligo 7.0软件设计所需引物,委托上海生工公司合成引物,各引物情况详见表1。③配制q RT-PCR反应体系如下:2×SYBRGreen Master Mix 12.5μL,上下游引物各1μL, c DNA 0.5μL,补加蒸馏水至总体系25μL。95℃预变性后,反应条件为:变性(95℃15 s)→退火(55℃15 s)→延伸(72℃45 s),共40循环。采用qRT-PCR仪进行扩增反应。实验重复3次。定量分析:以ACT1作为内参基因,分别测定每个样品目的基因Ct值。结果应用软件Graphpad Prism 5.0进行分析,基因表达水平用2-ΔΔCt法来计算倍数变化。

1.3 统计学分析

表1 白念珠菌c AMP相关基因引物序列表Tab.1 PCR primers for c AMP-related genes of Candida albicans

2 结 果

2.1 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌酵母-菌丝形态转化的影响

如图1所示,白念珠菌在含血清YPD液体培养基中生长3 h时,空白对照组、黄芩苷组(62.5 μg/m L)、氟康唑组(0.125μg/m L)以及两药联用组均为酵母相细胞;在6 h时,空白对照组形成大量菌丝,而黄芩苷组、氟康唑组菌丝较短,两药联用组可见酵母相细胞出芽但尚未形成菌丝;在9 h 时,空白对照组可见大量菌丝交织,黄芩苷组和氟康唑组可见较短菌丝的形成,而两药联用组则只有酵母相细胞,未见菌丝形成。

同时观察了含血清YPD固体培养基中两药联合对白念珠菌菌落边缘菌丝的影响。如图2所示,空白组白念珠菌菌落边缘形成浓密的长菌丝,而黄芩苷组、氟康唑组的菌丝则形成的较稀疏,且较短。而当两药联用时,白念珠菌菌落边缘光滑,菌丝消失。

2.2 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌胞内c AMP含量的影响以及回补实验的验证

c AMP是调节白念珠菌菌丝发育的一个重要成分。因此,我们进一步检测黄芩苷联合氟康唑干预后菌体内c AMP的含量变化。结果如图3所示,黄芩苷组和氟康唑组均不能降低胞内c AMP的含量(P＞0.05),而两药联用能显著降低胞内c AMP的含量(P＜0.05)。

同时,回补实验发现,在含血清YPD液体或固体培养基中,两药联用明显抑制生长。而当加入外源性c AMP(5 mmol/L)后,则菌丝生长的抑制现象被逆转,即菌丝又重新生长,提示两药联合对菌丝形成的抑制作用与胞内c AMP的含量密切相关(见图4)。

2.3 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌c AMP相关基因表达的影响

为了揭示黄芩苷联合氟康唑抑制C.albicans SC5314的具体作用机制,我们采用实时荧光定量PCR技术检测了调控c AMP产生进而影响菌丝发育的相关基因RAS1、CDC35和PDE2表达变化。结果如图5所示,黄芩苷联合氟康唑使RAS1和CDC35表达下调35%和27%,PDE2表达上调1. 21倍。

3 讨 论

在白念珠菌形态发生过程中,酵母相细胞出芽形成芽管,芽管进一步延伸发育成菌丝,菌丝相有助于其对宿主细胞的黏附和侵袭,还能逃逸免疫细胞的攻击,因此菌丝是构成白念珠菌的重要的毒力因子。

p H、温度、营养、药物等环境因素通过一定的信号转导途径影响白念珠菌菌丝的发育,其中Ras-c AMP途径近年来受到高度关注。研究表明,在白念珠菌菌丝发育早期阶段,菌丝诱导因子如血清,葡萄糖等激活Ras1G蛋白,后者作用于腺苷酸环化酶(AC)的Ras相关结构域,促进c AMP的产生,c AMP再活化c AMP反应性PKA,继而促进菌丝相关基因的转录,若c AMP的合成受到抑制即可阻断酵母相向菌丝相的转化[11]。为探讨该途径尤其是c AMP是否参与了黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌菌丝的抑制作用,我们通过菌丝诱导培养基(含血清YPD液体或固体培养基)观察了黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌菌丝的抑制作用。结果表明,与单用黄芩苷、氟康唑相比,两药联用对白念珠菌在液体培养基或固体培养基中的菌丝形成均能发挥显著抑制作用,而且发现两药联用可明显抑制白念珠菌胞内c AMP含量,当加入外源性c AMP之后,两药联合对白念珠菌造成的不能生成菌丝的缺陷可被逆转。由此说明,两药联合抑制菌丝形成的机制与降低胞内c AMP密切相关。

图1 黄芩苷联合氟康唑在含血清YPD液体培养基中对白念珠菌3 h、6 h、9 h菌丝形成的影响(BA:黄芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0. 125μg/m L;BA+FLC:黄芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 图2 黄芩苷联合氟康唑在含血清YPD琼脂中对白念珠菌菌丝形成的影响(BA:黄芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黄芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 图3 黄芩苷联合氟康唑对C.albicans SC5314胞内c AMP含量的影响(BA:黄芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黄芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L,与空白对照组相比**P＜0.01) 图4 外源性c AMP(5 m M)能恢复黄芩苷联合氟康唑对菌丝的抑制作用(BA:黄芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黄芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 图5 黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌c AMP相关基因表达的影响Fig.1 Effects of baicalin in combination with fluconazole on hypal formation in YPD liquid medium(containing serum)at 3,6,9 h(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.2 Effects of baicalin in combination with fluconazole on hypal formation in YPD agar medium(containing serum)(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125 μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.3 Reduced intracellular c AMP level by baicalin in combination with fluconazole(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L.Compared with control group,**P＜0.01) Fig.4 Exogenous c AMP(5 m M)reverts the morphological transition defect of C.albicans caused by baicalin in combination with fluconazole(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.5 Effects of baicalin in combination with fluconazole on the expression of C.albicans c AMP-related genes

c AMP是Ras-c AMP途径中的一个环节,该途径还涉及Ras1、Cdc35、Pde2等组分。其中,Ras1是该途径中与外界因素发生作用的上游组分,Cdc35是合成c AMP的腺苷酸环化酶,Pde2则是降解c AMP的磷酸二酯酶,为该途径的负调控组分[11]。我们利用qRT-PCR检测了这条通路中上述组分的转录水平,结果发现RAS1和CDC35基因表达分别下调35%和27%,编码磷酸二酯酶的基因PDE2表达上调1.21倍。仅从表达量结果来看,无显著性差异。由于Ras1、Cdc35、Pde2等是调控c AMP的上游组分,因此不排除两药联用后对上游其他组份(如Srv2,Gpa2等)的下调作用,但具体是哪些组分尚有待进一步验证。另外。c AMP水平降低是否影响到c AMP反应性PKA活化等环节也是下一步的研究内容。

综上所述,黄芩苷联合氟康唑显著抑制白念珠菌酵母-菌丝形态转化,其作用机制推测可能与Ras-c AMP信号通路中c AMP的下调有关。

参考文献

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[本文编辑]卫凤莲

·消息·

Effect of baicalin in combination with fluconazole against Candida albicans morphological transition from yeast to hyphae via inhibiting c AMP

FENG Xin,SHI Gao-xiang,YUN Yun,WU Da-qiang,SHAO Jing,WANG Tian-ming,WANG Chang-zhong
(School of Integrated Traditional and Western Medicine,Anhui University of Chinese Medicine,Institute of Integrated Traditional and Western Medicine,Anhui Academy of Chinese Medicine,Hefei 230038)

【Abstract】Objective This study aimed to investigate the antifungal activity of baicalin in combination with fluconazole against Candida albicans morphological transition from yeast to hyphae and to explore the mechanism.Methods The hyphainducing liquid and solid media were uesd to observe the effect of baicalin alone or in combination with fluconazole on yeasthapal transformation in C.albicans;The intracellular c AMP level and c AMP rescue was measured by ELISA Kit;Quantitative real time PCR(q RT-PCR)was performed to measure the expression of c AMP-related genes.Results Baicalin in combination with fluconazole could inhibit hyphae formation and intracellular c AMP level obviously;exogenous c AMP could convert hypha-inhibiting effect;And expression of RAS1 and CDC35 were downregulated by 35%and 27%respectively,while the expression of PDE2 was upregulated by 121%.Conclusion Mechanism of baicalin in combination with fluconazole inhibiting C. albicans morphological transition was probabaly via down-regulating the intracellular c AMP.

【Key words】C.albicans;baicalin;fluconazole;morphological transition;c AMP

[收稿日期]2016-01-15

通讯作者:汪长中,E-mail:ahwcz63@sina.com

作者简介:冯鑫,男(回族),硕士,讲师.E-mail:fx74@163.com

基金项目:安徽省自然科学基金项目(1408085MH165, 1508085MH163)

【中图分类号】R 379.4

【文献标识码】A

【文章编号】1673-3827(2016)11-0008-05