荧光标记技术在增殖放流中的应用现状

耿 倩,张淑荣,段 妍,刘 岩,孙典荣

( 1.天津农学院,天津 300384; 2.中国水产科学研究院 南海水产研究所,广东 广州 510300; 3.辽宁省海洋水产科学研究院, 辽宁 大连 116023 )

荧光标记技术在增殖放流中的应用现状

耿 倩1,2,张淑荣1,段 妍3,刘 岩2,孙典荣2

( 1.天津农学院,天津 300384; 2.中国水产科学研究院 南海水产研究所,广东 广州 510300; 3.辽宁省海洋水产科学研究院, 辽宁 大连 116023 )

荧光标记技术；增殖放流；荧光色素可见标志；荧光染料标记法

S937.3

标志技术是用来区分不同个体或种群的常用方法。自Petersen等[1]利用标志方法估算封闭水体中鱼类的利用率及种群大小后，标志技术在渔业和水产养殖研究中得到广泛的发展和应用，标记技术也不断更新。荧光标记技术是渔业和水产养殖研究中常用标志技术手段之一，其通过特定技术方法在标志对象上形成荧光标记进而通过肉眼或借助仪器发现该标记，主要有将荧光物质注入水生生物皮下形成荧光标记和应用荧光染料在水生生物钙质和骨质结构上形成荧光标记两种技术方法。荧光标记技术通常应用于临床医学中体外培养骨组织，也用于水产养殖中的优质苗种选育。其在增殖放流应用中，与以往标志标记方法相比，荧光标记具有效果显著、成本较低、对标记对象伤害较小等优点。近十几年来，科研人员开展了荧光标记技术的相关研究，取得了一些成果。笔者介绍了荧光标记技术的相关方法，阐述了有关荧光标记技术的主要成果，综述了各类标记方法的应用，比较了不同标记方法的优缺点及标记效果，探讨了荧光标记中存在的不足，展望了今后的研究方向，为进一步开展增殖放流试验研究和其他渔业水产研究提供理论参考。

1 荧光标记技术

在渔业资源增殖放流试验中荧光标记技术主要有荧光色素可见标志法和荧光染料标记法两种。其中荧光色素可见标志法通常利用标志枪将某种橡胶状物质和荧光染料组成的混合物植入标记目标皮下组织以形成有颜色的标志，是内部标志的一种；荧光染料标记法是将荧光染料通过投喂、浸染或注射等手段使其附着沉积于标志目标身体的钙化组织如鳞片、耳石和其他硬骨组织上，以产生在荧光显微镜下可识别的荧光标记或着色点标记，属化学标记技术，也属内部标记。

2 荧光标记技术的应用

2.1 荧光色素可见标志法的应用

荧光色素可见标志由荧光颜料和生物硅胶组成，以液态的方式注入到标记对象后可变为固态，其标志效果与标志时所选择的标志位置和标记颜色密切相关，一般将其注入到标记对象比较透明的部位，如鱼体头顶部、眼眶后部或背鳍和胸鳍之间，靠近胸鳍等部位，荧光的颜色通常有红色、橙色、黄色和绿色等[2]。与传统挂牌法相比较，荧光色素可见标志法更为有效。由于荧光色素可见标志法主要是通过渔民回收标志目标，因此标志位置需要较为醒目，以提高标记的可视性[3]。

荧光色素可见标志方法已经广泛应用于不同种类个体，依据种类、大小、标记位置的不同，其标志时间和保持率也不尽相同。例如在Pierson等[4]的试验中，饲养标志莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambica)110 d之后,荧光物质保持率为78%，而试验中草鱼(Ctenopharyngodonidella)经过238 d饲养之后,标志保持率为80%。Crook等[5]在试验中将荧光色素可见标志注入南乳鱼(Galaxiastruttaceus)鱼体的前鳃盖骨上，4 d和131 d后，标志保持率分别为100%和92%。Close等[6]采用荧光色素可见标志法标志虹鳟(Oncorhynchusmykiss)1龄幼鱼，主要标志位置在眼后脂肪组织及下颌腹面，在暗处可以采用紫外灯检测到荧光。Doupé等[7]应用荧光色素标记布氏棘鲷(Acanthopagrusbutcheri)的成活率高达100%，且将其注入尾鳍鳍条间的保持率最高。用荧光色素标记虹鳟和大西洋笛鲷(Lutjanuscampechanus)，结果显示该方法脱标率和死亡率均较低[8-9]。

很多研究表明荧光色素可见标志法适用于小型水生生物，并且标志对象与未标志对象在生长和死亡上没有明显不同[10]。在不同荧光色下研究这些标志对象，橘黄色标志在水中可见范围为8～10 m，远大于红色、绿色和黄色[11]。通过对红鳍东方鲀(Fugurubripes)、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、黑鲷(Sparusmacrocephlus)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)等不同个体研究发现，不同品种的试验对象标记效果有所不同[12-14]。

2.2 荧光染料标记法的应用

荧光染料标记法是将荧光染料通过投喂、浸染或注射等手段使其附着沉积于标志目标身体的钙化组织(如鳞片、耳石和其他硬骨组织)上,以产生在荧光显微镜下可识别的荧光标记或着色点标记。使用荧光染料标记法能在短时间内对处于鱼类生活史不同阶段的受精卵、仔稚鱼等实现大规模标记。渔业中较常见的荧光染料种类主要有氧四环素、盐酸四环素、钙黄绿素、茜素红以及茜素络合指示剂等，这些染料已经被证明能通过浸泡、投喂或注射等方法在标记目标身体的骨质结构上形成稳定的螯合物，从而在骨组织上生成生长标记，这种骨组织上的标记能够在荧光显微镜下被清楚地检测和观察，使用荧光染料进行标记的标志方法在渔业的相关研究中已得到越来越多的支持和应用[15]。

荧光染料标记法在鱼类、海绵类、腕足类、棘皮类等多种水生动物中作为生长标记的研究方法被广泛使用。研究结果表明，该标记方法在水生动物生长率调查、年轮和年龄鉴定以及种群区域鉴定等方面具有显著的效果[16-23]。例如，荧光染料标记鱼类耳石，通过荧光染料的浸泡，可在耳石上产生明显的化学标记[24]。

荧光物质会在鱼类耳石、鳞片和其他硬骨组织上形成永久性标记[25]，现今已有多种不同的荧光物质被广泛研究并使用[25-27]。不同标记染料应用在不同种类上，其染料用量、染色效果、染色时间和对目标生物的影响等，均会存在较大差异。从标记效果、标记效率、对目标生物的影响等方面来看，与挂牌标志法相比，荧光染料标记法更为有效。

在试验研究中，盐酸四环素作为化学染料，同时也是一种抗生素，若使用含量过高则对标记目标安全产生威胁。欧阳斌等[26]采用盐酸四环素浸泡标记稀有鲫(Gobiocyprisrarus)和彭泽鲫(Carassiusauratusvar. Pengze)，标记效果良好，标记率可达100%。付自东等[27]用荧光物质对胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)仔、稚鱼浸泡标记试验结果表明，盐酸四环素溶液对仔、稚鱼耳石的标记效果很差，且150 mg/L及以上质量浓度的浸泡液对稚鱼有较高致死作用，盐酸四环素不适于标记该鱼的耳石。许莉佳等[28]利用盐酸四环素标记斑马鱼(Dmiorerio)稚鱼，标记效果较好。何春林等[29]在浸泡标记重口裂腹鱼(Schizothoraxdavidi)仔鱼的试验中得出盐酸四环素不适合标记该鱼的结论。李敏达等[30]在对翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)稚鱼进行浸泡标记试验中，盐酸四环素质量浓度低时标记耳石效果不明显，并且在质量浓度为200 mg/L及以上时试验鱼出现死亡现象，稚鱼死亡率随质量浓度增大而增加，据此，盐酸四环素不适合用来标记该种鱼稚鱼。

钙黄绿素是荧光指示剂，主要用于络合滴定钙。但钙黄绿素产生的背景荧光较强，对某些硬骨组织具有自发荧光现象的鱼种可能其标记检测效果较差。许莉佳等[28]利用钙黄绿素标记斑马鱼稚鱼，由于试验中斑马鱼耳石自发荧光与钙黄绿素标记荧光相近，得出钙黄绿素不适合标记斑马鱼稚鱼的结论。李敏达等[30]使用钙黄绿素对翘嘴红鲌稚鱼进行浸泡标记试验，结果表明用300～350 mg/L的钙黄绿素浸泡该鱼，耳石可观察到较明显的标记。Moran[31]指出，钙黄绿素浸泡标记方法可以精确测量贝类生长情况，且不会影响贝类的存活或生长，是一种便于荧光检测并且标记持久的标志方法。Purcell等[32]应用钙黄绿素与四环素对仿刺参(Apostichopusjaponicus)幼苗进行浸泡标记，在12个月后，检测到标记保持率为100%，并且采样对刺参几乎无损伤。赵鹏等[33]用钙黄绿素标记仿刺参体壁、触手、管足、疣足真皮表层的骨片。综合以上研究结果，钙黄绿素应用于荧光标记中对标记生物影响较小，标记生物对钙黄绿素的适应性更强。

茜素红溶液是一种化工产品，常用作络合滴定指示剂和酸碱指示剂，亦可在水产研究中用作荧光染料。梁小双[2]采用茜素红浸泡标记红鳍笛鲷(L.erythopterus)，养殖60 d后，荧光标记依然明显可见，标记组与空白组的存活率、体长、体质量无显著差异。李敏达等[30]应用茜素红溶液对翘嘴红鲌稚鱼进行浸泡标记，结果表明，150 mg/L的茜素红溶液对稚鱼耳石有良好的标记效果，茜素红是标记翘嘴红鲌早期鱼苗的适宜荧光物质。赵亚鹏等[34]利用茜素红溶液对6日龄、20日龄及90日龄的滇池金线鲃(Sinocyclocheilusgrahami)仔稚鱼进行标志，标记物能在其耳石上形成深红色标记环带，标记率可达100%。王臣等[35]用茜素红标记大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)发眼后胚胎，经检测，茜素红可在矢耳石和微耳石上都能形成良好标记，在可见光和黄绿激光下均检测到标记带，但随着暂养时间的延长，可见光下标记逐渐减弱，至80 d基本消失，而在黄绿激光下标记区能长久保持，荧光强度无减弱迹象。Lagardere等[36]发现用高质量浓度的茜素红溶液可以在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)仔鱼耳石上形成清晰的荧光标记。

诸多研究也表明，用茜素络合物形成的标记质量要优于四环素[25,27，37]。采用茜素络合物溶液对鱼卵或仔鱼进行浸泡，可在耳石上形成可识别的荧光标记，其浸泡用量常为50～400 mg/L[36,38-39]。

付自东等[27]用荧光物质对胭脂鱼仔、稚鱼浸泡标记的试验结果表明，茜素络合物是对胭脂鱼早期鱼苗进行化学标记比较合适的荧光物质，100～200 mg/L的茜素络合物溶液浸泡24 h对胭脂鱼仔、稚鱼耳石有很好的标记效果。欧阳斌等[26]采用茜素络合物浸泡标记稀有鲫和彭泽鲫鱼，标记效果良好，标记率可达100%。何春林等[29]在浸泡标记重口裂腹鱼仔鱼的试验中，得出茜素络合物对该鱼是较合适的化学标记荧光物质的结论。靳建波等[40]釆用茜素络合物浸泡标记秦岭细鳞鲑(Brachymystaxlenoktsinlingensis)发眼卵和幼鱼，浸泡发眼卵的最佳质量浓度为30 mg/L，浸泡18 h，标记率可达100%，出膜后幼鱼存活率可达91%，耳石标记明显；幼鱼浸泡的最佳质量浓度为120 mg/L，浸泡12 h，标记率可达83.3%，15 d后，存活率可达92.3%，耳石标记较明显。郝振林等[41]用茜素配合指示剂浸泡标记金乌贼(Sepiaesculenta)幼体，标记金乌贼的成活率可达标记效果明显，标记可用肉眼直接观察。梁小双[2]采用茜素配合指示剂浸泡标记红鳍笛鲷，养殖60 d后，荧光标记依然明显可见，标记组鱼与空白组鱼的存活率、体长、体质量无显著差异。赵天等[42]在用茜素络合物浸泡处理唐鱼(Tanichthysalbonubes)仔鱼、稚鱼和成鱼时，水温28～30 ℃，浸泡时间24 h，唐鱼仔、稚鱼最适的茜素络合物溶液浸泡用量为80 mg/L，唐鱼成鱼最适浸泡用量为150 mg/L，并且，茜素络合物对唐鱼仔稚鱼鱼体生长没有明显影响。赵亚鹏等[34]利用茜素络合物水溶液对6日龄、20日龄及90日龄滇池金线鲃仔稚鱼进行标记，标记物能在其耳石上形成深红色标记环带，可以保证100%的标记率。

以上提到的4种染料，除盐酸四环素质量浓度过大会降低标记目标的存活率、钙黄绿素产生的背景荧光较强外，其他3种在荧光标记应用中表现良好，对标记目标无明显损害，可以保证标记质量，是有效的标记方法。

3 荧光标记技术的优缺点

在增殖放流的应用研究中，荧光标记技术有成本低廉、对标记目标伤害刺激小标记时间长的优点，但也有标记不明显、有时需用专业设备检测、不利于回捕的缺点。

3.1 荧光色素可见标志的优缺点

优点：荧光色素可见标志法适于许多鱼类和甲壳类，可用于小型水生动物(或生物幼体)的标记；操作容易简单，标志明显；标志样式可个体鉴定；高保留率；对存活、生长、行为影响限度小；标志费用低；检测直观，发荧光时可见度大大增强，在夜晚用蓝色发光二极管观察标志明显。

缺点：荧光色素可见标志法不具备编码功能，一般无法使用单独加标；检测难度较大，需要特殊的设备和工具；加标于头部的种类假如头部失去，则标志丢失；当该标志处在色素组织下方时检测困难。

3.2 荧光染料浸泡标记法的优缺点

优点：荧光染料标记法标记方法简单，可用于大规模标记，其适用范围广，标记保存率高且易于被发现，对标记目标损伤较小。使用荧光物质标记法进行标记能够减少对标记目标的操作，降低胁迫和死亡率，并且该方法能够实现一次性的大规模放流标记活动。

缺点：过高的染料浸泡用量、过长的浸泡时间等都可能对被标记生物产生急性或慢性毒害作用，影响被标记生物的生长、发育、行为，甚至会造成死亡。并且，标记相对于体外挂牌法等常用方法可能不明显，在应用于标志回捕时不易于被渔民发现、回收。

4 总结与展望

荧光标记技术具有适用种类广、标记显著、操作简单、对标记对象影响小的技术特点，尤其在生活史早期阶段具有其他标志技术所不具备的优势，这些特点使其能够在水生生物标志技术应用领域占有一席之地，国内外学者纷纷开展了许多与之相关的研究工作，取得了丰硕的研究成果，该技术在水生生物标志技术应用领域具有广阔的研究应用前景。

荧光染色标记技术为我国引进的标记方法之一，该技术在渔业和水产养殖研究中仍然具有很大的应用潜力。在未来的研究中，笔者认为，此项技术或可从以下几个方面进行突破：(1)改进检测设备，进行研究升级使之更加小巧灵活便于携带，提高对标记的识别率；(2)对标记所用材料、方法进行研究，提高标记的被识别率；(3)荧光染料浸泡标记法中所形成的荧光标记是永久性标记，形成的螯合物虽然对标记目标损伤较小，但如今食品安全问题备受关注，被标记后的个体是否存在食品安全问题，尚未得知，亟需科研工作者进行回答；(4)开发新型安全、稳定、可食用染料，为渔业和增殖放流试验中荧光标记法提供更多的染料选择，也应在将来开展有关研究的考虑范围之内。

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ApplicationStatusofFluorescence-labeledTechniqueinStockEnhancement

GENG Qian1,2, ZHANG Shurong1,DUAN Yan3,LIU Yan2, SUN Dianrong2

( 1.Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384,China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 3. Liaoning Ocean Fishery Science Research Institute, Dalian 116023, China )

fluorescent marking;stock enhancement;visible implant elastomer tag;fluorescein labeling method

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.021

C

0308-05

1003-1111(2016)03-

2015-11-09；

2016-01-21.

珠江及河口渔业资源评价与增殖养护技术研究项目(201303048);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(2015TS07)； 大亚湾增殖放流效果评估和跟踪监测项目(2130135020).

耿倩(1991—), 女, 硕士研究生; 研究方向:渔业资源调查与增殖放流效果评估.E-mail:gengsd@163.com. 通讯作者: 孙典荣(1973—),男,研究员;研究方向:海洋渔业资源评估与海洋生态.E-mail:drsun73@163.com.