连南县茶树种质资源遗传多样性的RAPD分析

李华锋，滕杰，莫岚，曾雯，晏嫦妤，黄亚辉

连南县茶树种质资源遗传多样性的RAPD分析

李华锋，滕杰，莫岚，曾雯，晏嫦妤*，黄亚辉*

(华南农业大学园艺学院，广东广州510642)

用RAPD分子标记对广东连南县涡水、黄连和大龙3处茶树群体的45份种质资源进行了遗传多样性分析，从DNA角度深入探讨了连南茶树的分类及其亲缘关系。利用已筛选好的17条扩增效果良好的引物进行RAPD扩增反应后，共扩增出124条谱带。其中多态性带为119(占96.0%)，总的Nei's基因多样性指数(H)和香浓信息指数(I)分别为0.491和0.684。根据RAPD分析结果，通过UPGMA类平均法聚类法，对45份茶树种质资源进行聚类分析，结果表明:3处茶树群体的供试材料基本上都可以各组聚成一类。从上述的结果可得:连南茶树种质资源的遗传多样性高、遗传基础丰富且具有明显的地域独特性;连南茶树种质资源群体之间存在着较大的遗传分化。

连南;茶树种质资源;遗传多样性;RAPD

连南瑶族自治县，位于广东省的西北部，东北与连县交界，东南与阳山相连，南接怀集县，西邻连山壮族瑶族自治县，西北与湖南江华瑶族自治县接壤。连南地处萌诸岭山脉南麓，四面环山，中部比较平坦，属于中亚热带季风湿润气候区，光照强，雨量充沛，有雨热同季的优势，四季分明，立体气候明显，素有“九山半水半分田”之称［1］，适合各种农作物生长，也是茶树生长的好地方。茶叶是连南的特色农产品之一，早在清朝末年就有栽种。民国时期的《连县志》记载到:“茶叶产量以大龙最多，并将黄连茶作为地方特产茶。”目前连南大力发展茶业，茶园面积和茶叶产量大大增加，全县有7个乡镇(大麦山镇、寨岗镇、大坪乡、盘石乡、金坑乡、山联乡、寨南乡)产茶，茶园面积达到500 hm2，茶叶年产量达到50 t。连南的黄连红茶、大叶茶、天堂茶、高界茶、中坑茶、大龙茶等品质均较好，广受外界关注［2］。邱陶瑞，方金福，余宗泽等于1982年10月和1983年4月对连南茶树资源的植物学特征、制茶品质、生化成分做了相关的调查和研究，取得了一定的成果，但至今尚未从DNA分子水平对连南茶树种质资源进行分析。

随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸单链做引物，通过PCR扩增反应产生不连续的DNA产物，经电泳检

测其多态性。RAPD分子标记技术于20世纪90年代中期应用在茶树遗传多样性研究中，世界主要茶产区学者利用此分子技术研究茶树遗传多样性都有相关报道。吴美贞［3］对韩国35个自生茶树的RAPD分析表明其遗传多样性达84.5%;Warchira等［4］用RAPD标记技术对肯尼亚茶树种质资源进行研究分析，得出其遗传多样性高达93%;陈亮［5－7］、陈海军［8］、沈程文［9］、邵宛芳［10］等的研究结果表明我国的茶树种质资源也具有很高的遗传多样性。笔者利用RAPD标记技术对连南45份茶树资源的遗传多样性进行研究，旨在为了解连南茶树种质资源的遗传背景和进一步发掘、利用和保护该地区茶树种质资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料分别采自黄连、涡水和大龙，其地理分布点见图1。黄连25份茶树资源，海拔为300 m左右;涡水13份茶树资源，海拔为400～500 m;大龙7份茶树资源，海拔为620 m左右。各茶样的基本情况见表1。其茶叶鲜叶采摘于2016年4月 5～9日，采摘标准为1芽2叶，样品采摘后储存于－80℃冰箱备用。

图1 连南茶树种质资源地理分布点ig.1Geographical distribution of tea germplasms from Liannan

表1 茶树45份试验材料Table 1Names and codes of 45 tea germplasms

1.2 DNA提取

样品DNA提取采用的是改良后的CTAB法［11］。DNA样品加ddH2O稀释至100 μg·L－1，取溶解后的5 μL，加1 μL上样缓冲液，采用1.2%琼脂糖凝胶，在120 V电压下电泳20 min后，于凝胶成像系统(Syngene，G:Box EF)下鉴定DNA片段大小并拍照(图2)，其余DNA样品放在－20℃冰箱分装保存。

图2 基因DNA琼脂糖电泳检测图Fig.2Genomic DNA by agarose gel electrophoresis

1.3 RAPD扩增反应

20条随机引物由上海生物工程公司合成，从中筛选出17条多态性好、清晰度高的随机引物(S3、S4、S11、S28、S35、S53、S78、S86、S89、S94、S1010、S1106、S1127、S1130、S1464、S1469、S1510)对45份茶树叶片DNA样品进行RAPD扩增反应，其编号和序列见表2。RAPD－PCR反应体系为25 μL，包括，模板DNA 1μL，引物0.5 μL，ddH2O 11μL，2(PCR mix(含taq酶，dNTP，Mg2+等)12.5 μL。PCR反应在PCR仪(Eppendorf 5331 Mastercy Cler Gradient)上进行。PCR扩增程序: 94℃预变性3 min，94℃变性50 s，37℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。RAPD－PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶在120 V电压下电泳50 min，电泳结果用凝胶成像系统(Syngene，G:Box EF)观察与拍照。

1.4 数据处理

假定图谱中每条谱带代表一个独立遗传位点的显性等位基因，各样品中每一位点条带(只记录强带)显现记为“1”，无带和弱带记为“0”，重复的条带不记入数据分析。为了减少人为误差，是由2人分别进行记录与核对。根据“0/1”原始矩阵，使用NTSYS2.10e(Exter Software，NY，USA)软件计算所有样品间得到相似系数，并基于UPGMA构建聚类树图。计算每个引物的多态性百分数(多态性条带数/总条带数)［12］。利用POPGEN 1.32软件计算3个茶树群体的Nei's遗传多样性指数(H)，Shannon信息指数(I)，总基因多样度(Ht)，群体内基因多样度(Hs)，群体间基因分化系数(Gst)，基因流(Nm)，Nm=0.5(1－Gst)/Gst［15］。

2 结果与分析

2.1 RAPD多态性分析

由上海生物工程公司合成的20个随机引物中筛选出17个引物对供试样品进行RAPD扩增，筛选的依据主要是多态性程度和扩增的重现性［6］。这17个引物在连南45份茶树资源中共扩增出124条谱带，其中119条为多态性带，其多态性程度高达96.0%，平均每个引物产生7.3条带和7.0条多态性带(表2)。每个引物扩增的条带数在4条(S1010)到10条(S28、S89)之间，多态性条带3～10条。部分引物扩增结果见图3。

表2 筛选出引物的RAPD扩增结果及其多态性Table 2Amplified products using selected primers and their polymorphism

图3 引物S1127对45个供试样品的RAPD扩增电泳结果Fig.3Amplified results of 45 tea samples using S1127 primer

2.2 基于RAPD－PCR结果的连南茶树种质资源的多样性水平分析

对连南涡水(G)、黄连(H)和大龙(D)茶树群体共45份资源基于RAPD－PCR结果进行了多样性水平分析，其具体结果见表3。3个群体总的Nei' s基因多样性指数和Shannon指数分别为0.491和0.684，高于G(H=0.489，I=0.682)、H(H=0.481，I=0.674)和D(H=0.472，I=0.664)。同时也可得3个群体中涡水茶树种质资源遗传多样性比其他2个茶树群体丰富。

表33 个茶树群体种质资源的多样性水平Table 3Diversity of 3 tea germplasms

表4显示45份茶树种质资源总的基因多样度Ht=0.49，其基因多样度Hs=0.37，因此可得基因多样度(Hst=Ht－Hs)为0.12，进而可知3处群体的45份茶树资源内基因多样度结果(1－Hst/ Ht=75.51%)，群体内的遗传变异占3个群体总变异的遗传多样性的75.51%，证明75%以上遗传变异来自这个群体内。另外，3个茶树群体间的基因分化系数Gst=0.24，进一步说明遗传差异少部分来自群体间。由此可得，3个茶树群体资源携有连南茶树原种相近的基因源。本研究可得基因流Hm =1.57＞1，表明连南茶树种质资源群体之间有一定的基因流。

表43 个茶树群体种质资源的Ht、Hs、Gst及Nm值Table 4Ht，Hs，Gst and Nm of 3 tea germplasms

2.3 基于RAPD－PCR结果的连南茶树种质资源的聚类分析

根据RAPD扩增数据，使用NTSYS2.10e软件计算所有供试材料得到相似系数，并基于UPGMA构建聚类树图(图4)。分析结果可得其遗传相似系数0.44～0.89，在45份茶树资源中黄连8号和黄连9号的亲缘关系最近，其遗传相似系数为0.89，说明其在基因组成和核苷酸序列上极为相似。黄连5号与涡水4号的遗传相似系数为0.44，说明它们之间的亲缘关系较远。在遗传相似系数为0.66时，分成3个大类群和1个小类群:类群Ⅰ为涡水1～6，8～13号、黄连1，2号、大龙3号;类群Ⅱ为黄连6～25号;类群Ⅲ为大龙1，2，4～7号、黄连3号;类群Ⅳ为小类群，有涡水7号与黄连4，5号。3个群体的供试样品基本上都可以各自聚成一类，特别是类群Ⅱ，说明连南茶树种质资源具有很强的地域性。此处等级划分突出了连南县3个茶树群体之间的遗传多样性以及亲缘关系。

3 讨论与结论

3.1 连南茶树种质资源遗传多样性

图445 个供试样品的分子系统树状图Fig.4Molecular dendrograms on 45 tea germplasms

遗传多样性是生物所携带的遗传信息的总和，是群居生存、发展和进化的基础［13］。在参考遗传多样性的参数中，多态性位点百分率(PPL)、多态性百分数(P)、Nei's基因多样性指数(H)和Shannon's信息指数(I)能够反映的遗传多样性程度。沈程文等［9］对安化云台山茶树品种种群内遗传多样性的RAPD分析表明，其P=79.33%;林郑和等［14］对我国39个茶树品种的RAPD分析结果表明，其P=87.2%;鄢东海等［15］对贵州地方茶树品种资源遗传多样性RAPD分析表明，其PPL= 100%、H=0.36与I=0.54。在本研究中，连南茶树种质资源的PPL=100%、P=96.0%、H= 0.491和I=0.684都处于较高的水平，反映出连南茶树种质资源遗传多样性丰富。

遗传分化是指遗传多样性在群体内和群体间的分布。Wright［16］指出遗传分化系数Gst在0～0.05之间表明遗传分化极弱，在0.05～0.15表明Gst遗传分化中等，在0.15～0.25表明遗传分化较大。本研究中得出Gst=0.24，说明连南茶树种质资源群体之间存在着较大的遗传分化。基因流Nm是影响植物种群遗传结构的重要因子，在濒危植物的保护中有重要的意义［17］，也是影响自然植物遗传变异度的关键因子之一。Wright［18］表明如果Nm＜1，则是由于遗传漂变导致群体间明显的遗传分化，本研究中基因流Nm=1.57＞1，说明群体间的遗传分化不是由于遗传漂变产生的，而不同海拔高度上群居所处生境的各种生态因子(气候、温度、土壤等)的差异性可能是导致品种间遗传分化的主要原因。衡量群体间遗传分化程度的另一个重要的指标是遗传相似系数。在本研究中，不同海拔的茶树群体间的遗传相似系数差异较大，结果可得涡水、黄连和大龙茶树群体间的遗传相似系数分别为:0.56～0.85、0.52～0.88和0.65～0.80，由此可得3个茶树群体间的遗传相似度呈现出低－高－低的规律。

3.2 连南茶树种质资源的利用与保护

一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小［19］。高的遗传多样性是维持物种长期生存的基础，一个只有纯合子构成的物种是很难长期维持稳定的，因为它很难适应不断变化的环境压力。多态性百分数是衡量一个种群遗传变异水平高低的一个重要指标。一个种群多态性百分数高说明这个物种适应环境能力较强，反之，种群多态性百分数低，适应环境的能力弱，在长期的进化过程中就有被淘汰的可能性［20］。本研究结果表明连南茶树种质资源遗传多样性丰富，这说明其物种适应环境的能力较强，但是由于当地的靠山村民只顾采摘方便，不少茶树尾部都被砍掉了，也有不少茶树被砍掉当柴火或者建筑用，使得茶树资源受到严重破坏。从图4的聚类分析中可以看出涡水7号、黄连4号和黄连5号聚成一小类，说明它们有着独特的遗传关系。它们的基因与其他样品比较，差异较大，也很有望成为连南茶树种质资源中的特色资源。但这些资源一旦灭绝就意味着其中一个群居的丧失，将严重地影响到连南茶树种质资源整个种群的群居规模和遗传多样性，因此对于这些具有独特遗传特性的资源应加以重点保护。

本研究初步从DNA水平证实了连南茶树种质资源具有丰富的遗传多样性，为进一步发掘优异茶树种质资源，建立连南茶树种质资源信息库，培育新良种提供了分子生物学依据。从而减少了育种过程中的工作量和盲目性，提高了育种效率

［1］连山壮族瑶族自治县志编纂委员会.连山壮族瑶族自治县志(1979～2005)［M］.广东:方志出版社，2005:1－2.

［2］邱陶瑞，方金福，余宗泽.连南种茶树的调查［J］.中国茶叶，1985，(6):30－32.

［3］吴美贞.Studies on genetic relationship among the Korean native tea trees and physicochemical properties of its green tea［D］.韩国:高丽大学校大学院农学科，1994:27－29.

［4］Warchira F N.Genetic diversity in tea revealed by randomly amplified polymorphic DNA markers［J］.Tea，1996，17(2): 60－68.

［5］陈亮，杨亚军，高其康，等.15个茶树品种遗传多样性的RAPD分析［J］.茶叶科学，1998，18(1):21－27.

［6］陈亮，山口聪，王平盛，等.利用RAPD进行茶组植物遗传多样性和分子系统学分析［J］.茶叶科学，2002，22(1): 19－24.

［7］陈亮，虞富莲，杨亚军，等.茶树优质资源遗传稳定性的RAPD分析［J］.茶叶科学，1999，19(1):13－16.

［8］陈海军，赵东，刘祖生.浙江部分茶树良种的RAPD分子鉴定［J］.茶叶，2002，28(3):119－121.

［9］沈程文，罗军武，施兆鹏，等.安化云台山茶树品质种种群内遗传多样性的RAPD分析［J］.湖南农业大学学报，2002，18(4):320－325.

［10］邵宛芳，庞瑞华，王平盛，等.云南茶树种质的RAPD研究［J］.中国农业科学，2003，36(2):1582－1587.

［11］唐玉海，郭春芳，张木清.一种提取茶树基因组DNA的方法——改良的CTAB法［J］.福建教育学院学报，2007，(1): 99－100.

［12］Belaj A，Trujilo I，RosaR，etal.Polymorphismand discrimination capacity of randomly amplified polymorphic markers in an olive germplasm bank［J］.J Amer Soc Hort Sci，2001，126(1):64－71.

［13］陈灵芝.中国的生物多样性现状及其保护对策［M］.北京:科学出版社，1993.

［14］林郑和，陈常颂，陈荣冰.我国39个茶树品种的RAPD分析［J］.分子植物育种，2006，4(5):695－701.

［15］鄢东海，刘声传，罗显扬，等.贵州地方茶树品种资源遗传多样性RAPD分析［J］.中国农学通报，2015，31(19): 30－34.

［16］Wright S.Evolution and the genetic of population.Vol.4.Variability within and among natural populations［M］.University of Chicago Press，Chicago，IL，1978.

［17］陈小勇.植物的基因流及其在濒危植物保护中的作用［J］.生物多样性，1996，4(2):97.

［18］Wright S.The genetical structure of populations［M］.Ann. Eugen.，1951，15:323－354.

［19］Grant V.The evolutionaryProcess:ACriticalStudyof Evolutionary Theory(2nded)［M］.New York:Columbia Ilniversitv Press，1991.

［20］顾万春，王棋，游应天，等.森林遗传资源学概论［M］.北京:中国科学技术出版社，1998:1－29.

RAPD Analysis on Genetic Diversity of Tea Germplasms from Liannan County

LI Hua-feng，TENG Jie，MO Lan，ZENG Wen，YAN Chang-yu*，HUANG Ya-hui*
(College of Horticulture South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China)

Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis was applied to determine the genetic variations among the 45 tea germplasms from Guoshui，Huanglian，and Dalong in Liannan County，Guangdong.Based on their DNA makeups，the classification and genetic relationship of the germplasms were analyzed.From the 124 bands amplified by 17 selected primers，119 polymorphic bands were found，and the total Nei's gene diversity and Shanon indices were determined to be 0.491 and 0.684，respectively.It appeared that the 45 tea germplasms from Liannan could be classified by UPGMA into 3 categories with a significant genetic diversity and regional distinction.

Liannan;tea germplasms;genetic diversity;RAPD

S571.1

A

2096－0220(2016)04－0166－06

2016－10－11初稿;2016－10－29修改稿

广东省科技计划项目(2013B020201003、2015B020202007、2016A020208012、2016A020210070);福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心专项(闽教〔2015〕75号);广东省产业体系(2016LM1117);桂科AB16380063。

李华锋(1992－)，男，在读研究生，研究方向:茶树种质资源与生物技术研究。E－mail:13422059960@163.com

*通讯作者:晏嫦妤(1981－)，女，助理研究员，博士，研究方向:茶树资源及利用。E－mail:sally8191@126.com黄亚辉(1969－)，男，研究员，博士，研究方向:茶叶加工及深加工。E－mail:13501513191@163.com