枣树花药组织培养研究进展

段元杰，刘海刚，孟富宣，杨玉皎，周 军

(1.云南省农业科学院 热区生态农业研究所，云南 元谋 651300；2.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224)



枣树花药组织培养研究进展

段元杰1，刘海刚1，孟富宣1，杨玉皎1，周 军2*

(1.云南省农业科学院 热区生态农业研究所，云南 元谋 651300；2.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224)

综述了枣树花药培养的研究进展，系统的介绍了影响枣树花药培养效率的主要因素，指出了目前枣树花药培养中存在的问题，并对枣树花药培养的研究前景进行了展望。

枣；花药培养；影响因素；研究进展

我国新审定的枣树品种大部分来源于地方品种选优和实生选种，枣树新品种的创新程度低，因而不能很好地弥补现有枣品种中存在的缺陷[1]。常规育种方法由于枣树花小、人工去雄易伤害花器官、花量大而坐果率低、存在胚败育等都制约着枣树杂交育种工作的发展[2]。自1964年毛叶曼陀罗离体花药培养获得单倍体植株以来[3]，在离体条件下培养花药或花粉，受到广泛重视，曾被认为是植物品种改良的捷径，并在许多植物上成功应用[4]。自20世纪90年代以来，逐渐出现了枣树花药培养的研究报道，王震星等[5]对金丝小枣树花药进行培养，从愈伤组中分化出植株，获得单倍体5株。王娜[6]通过对三倍体的赞皇大枣花粉进行组织培养获得了1株二倍体植株。武晓红等[7]对赞皇大枣、冬枣、辣椒枣、阜平大枣和月光枣5个供试枣品种进行花药组织培养，获得冬枣单倍体植株2株和阜平大枣单倍体植株1株。到目前为止枣树花药培养中单倍体植株诱导率还比较低，且不可避免地产生体细胞混杂、植株生长势弱等问题，且仍未得到有效解决。

1 影响枣树花药培养的因素

1.1 基因型

不同基因型植株花药对培养的反应不同，表现在愈伤组织诱导率、分化率等方面。韩晶等[8]对2种制干枣树品种花药愈伤和芽诱导的研究表明，不同基因型的材料在相同培养条件下愈伤情况不同，不定芽的分化也不同，且差异明显。王敬东等[9]以宁夏3个特色枣树品种的花药作为外植体培养，得出相似的结论，不同枣树品种的花粉在相同培养基中愈伤诱导率和分化率存在差异，且不同基因型所适合的诱导和分化培养基均不同。郝征[10]以冬枣和月光枣为供试材，建立了枣树花药愈伤再生体系，发现品种不同，其愈伤和芽的诱导率也不同，而且诱导率差异悬殊。武晓红等[11]选用5个不同基因型的枣树品种花药培养，研究不同基因型花药愈伤组织的生长情况，都获得愈伤组织并分化出芽，但不同基因型的材料之间愈伤诱导率存在显著差异，最高为100%，最低的仅为46.67%；阜平大枣的愈伤组织分化率显著低于其他4个品种。

1.2 取材时间

在花药培养时，接种花粉所处的发育时期是影响培养效果的重要因素。就多数植物而言，单核中期和单核靠边期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。王震星等[12]经多次取材试验发现，当金丝小枣花蕾和花粉为绿色和黄绿色时，多为花粉的单核靠边期，此时接种培养，较易诱导出愈伤组织。从采集时间来看，以5月中旬至5月下旬采集的花药较易获得愈伤组织。吴丽萍[13]研究了冬枣花蕾的形态特征与花药愈伤组织诱导率的相关性，结果表明：冬枣黄绿色和淡黄色时期的花蕾愈伤组织诱导率明显高于其他颜色时期愈伤组织的诱导率。牛瑜菲[14]指出了培养的最佳时期为单核靠边期，此期花蕾为黄绿色，五角逐渐变圆，花药为淡黄色；并指出了不同品种之间单核靠边期花蕾大小略有差异，酸枣花蕾横径1.9 mm左右，纵径1.0 mm左右；苹果枣和骏枣花蕾横径为2.0 mm左右，纵径1.1～1.8 mm之间；赞皇大枣花蕾横径2.7 mm左右，纵径1.6 mm左右。然而以外部形态来确定小孢子发育时期并不是十分准确。周林等[15]认为花蕾外部形态容易受到品种、植株的年龄、生长状况、外部环境条件、季节和人为管理的影响。武晓红[7]研究了不同颜色的花蕾对愈伤组织诱导效果的影响，并对不同发育时期的花粉进行镜检，结果表明：由于品种的不同，小孢子在适宜离体培养的单核靠边期所对应的花蕾外部形态会有所差异，但该时期花蕾一般为绿色到黄绿色。韦鹏霄等[16]研究了番茄花蕾外部形态与花粉发育时期的相关性认为，在以番茄花蕾外部形态(如花蕾长度)为花药培养取材依据时，还应该配合采用镜检鉴定的方法来确定花粉发育时期，以利于增强对接种材料的选择性，提高番茄花药培养的诱导率。由于受诸多因素的影响，枣树相似的花蕾外部形态下单核靠边期花粉细胞占总花粉细胞的比例可能有很大差异，外部形态观察结合镜检鉴定是一种可提高对接种材料选择性的方法[17-22]。

1.3 预处理

在花药培养中，接种培养之前对花药进行适当的预处理，能诱发花药内源激素、mRNA、蛋白质及糖类物质的含量发生变化[23-25]，提高小孢子的生活力，延长花粉的寿命，使药壁细胞和绒毡层逐渐退化，小孢子孤立[26]，促使花药内小孢子完成从活体内配子体发育转为类似离体下的孢子体发育，显著地提高小孢子发育成为单倍体植株的诱导率[13]。

武晓红[7]研究发现，阜平大枣和赞皇大枣的花药经甘露醇预处理后愈伤组织诱导率均有提高，以0.1 mol/L甘露醇处理3 d时的出愈率达到最大。处理天数对出愈率的影响已达到显著水平且明显大于不同浓度对出愈率的影响。吴丽萍[13]在冬枣树花药培养中用甘露醇进行预处理，经甘露醇处理后花药愈伤组织诱导率得到显著提高，在浓度为0.4～0.6 mol/L时的诱导率达到最大。另外低温预处理在枣树花药培养中也是比较常见的方法。王震星等[12]以金丝小枣离体花药为试材进行5 ℃低温预处理使得愈伤组织诱导率明显提高，以处理5 d时达到最高，但不同处理时间之间的诱导率无显著差异。王艳[20]发现低温预处理不但有利于花药愈伤组织的诱导，而且对花药愈伤组织的分化有促进作用。武晓红等[27]则持不同观点，他以赞皇大枣、冬枣、月光枣、阜平大枣和辣椒枣树花药进行试验，得出低温预处理对枣树花药愈伤组织的诱导没有产生正面影响，甚至有些品种的诱导率明显下降。牛瑜菲[14]也证实了不是所有的枣树品种在低温处理后诱导愈伤组织时都会表现正向的促进作用。低温处理后骏枣没有明显变化，赞皇大枣诱导率反而下降。不同的枣树品种花药在相同的预处理之后呈现出表现型上的差异，也间接地反映了基因型在花药培养中的决定作用。

1.4 基本培养基及其附加成分

1.4.1 基本培养基 木本植物花药培养所采用的基本培养基有MS、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6、Miller、H。较为常用的是MS、BN、H、MB培养基[17]。王娜等[18]将冬枣未成熟花蕾接种在MS、B5、MT、WPM培养基上，结果表明：MS基本培养基上的愈伤组织诱导效果最好，添加适当的激素后获得较高的愈伤组织诱导率，并诱导出胚性愈伤组织。韩晶等[8]比较了MS、1/2MS培养基对愈伤组织诱导率的影响，结果表明：这2种基本培养基对诱导长红枣树花药愈伤组织的出愈率影响差异不显著。

1.4.2 碳源 糖作为碳源，为接种的材料提供能量，并且可以调节渗透压，在组织培养中起重要作用。王震星等[12]在添加3%蔗糖的培养基上诱导出金丝小枣树花药的愈伤组织，并且进一步分化获得再生植株。王艳[20]通过综合分析也认为3%的蔗糖浓度普遍适用于枣树花药愈伤组织的诱导和愈伤组织分化获取再生植株。韩晶等[8]比较了以蔗糖和麦芽糖为碳源时愈伤组织的诱导情况，发现添加麦芽糖时，花药愈伤组织褐化、死亡率低，出愈率高，更适合用作枣树花药愈伤组织诱导的碳源。王娜等[18]比较了蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖在冬枣树花药培养中的效果，认为麦芽糖在冬枣树花药愈伤组织诱导中的作用优越于其他碳源。吴丽萍[13]综合评价愈伤质量和培养过程中的褐化情况认为3%麦芽糖适合冬枣树花药愈伤组织的诱导。武晓红[7]通过试验得出相似的结论，认为在诱导花药愈伤组织诱导、愈伤组织分化出苗2个阶段，在麦芽糖为碳源的培养基上愈伤组织生长旺盛，增殖迅速，芽点分化快，效果明显优于蔗糖和葡萄糖。

1.4.3 激素 花药愈伤组织的生长情况很大程度上取决于培养基中激素的种类、浓度和配比。枣树花药离体培养中最常使用的是NAA、6-BA、2，4-D。对于诱导愈伤组织的培养基，王震星等[19]在金丝小枣树花药培养过程中发现2，4-D和NAA是诱导愈伤组织的关键，且两者适当的配比比单一附加2，4-D或NAA的诱导率高，并指出最佳的配比是2，4-D 1.0 mg/L和NAA 0.4 mg/L。这一结论一直被后来的学者所借鉴并得到证实。郝征[10]发现不同的植物生长调节剂对枣树花药愈伤组织的诱导率以2，4-D最高，其次是NAA、TDZ，而GA3不适合诱导枣树花药愈伤组织。武晓红[7]也提到GA3对试验材料愈伤组织的发生没有作用。牛瑜菲[14]指出TDZ和NAA的组合有利于花药愈伤组织的诱导。王艳[20]在试验后也认为TDZ和NAA对愈伤组织的诱导有普遍的积极作用，有利于花药愈伤组织的诱导。王敬东等[9]在花药愈伤组织的诱导培养基中以生长素2，4-D和NAA、IBA的组合均未能诱导出愈伤组织，添加细胞分裂素6-BA后诱导效果明显改善，认为6-BA对愈伤组织的诱导具有重要作用。武晓红等[11]认为TDZ、2，4-D、NAA均可诱导出花药愈伤组织，只是不同的品种对激素的敏感度不同。对于分化培养基，武晓红等[11]发现枣树花药愈伤组织的分化在分裂活性较强的TDZ的刺激下能分化出再生植株，在添加三十烷醇的培养基上能得到较高的分化率。韩晶等[8]发现适当提高6-BA的添加量有利于愈伤组织不定芽的分化。王震星等[19]认为6-BA是金丝小枣愈伤组织分化成小植株的决定因素。王艳[20]试验后得出6-BA和IBA的组合适合枣树花药愈伤组织的分化，有利于获得再生植株。王敬东等[9]认为6-BA和IBA低浓度配比所获得的分化率高于高浓度配比的分化率。

1.4.4 硝酸银 王敬东等[9]在以特色枣树为试材的分化培养基中添加适量硝酸银，获得的分化率普遍高于未添加硝酸银的培养基。吴丽萍[13]在冬枣树花药组织培养研究中添加10 μmol/L的硝酸银溶液，提高了愈伤组织的增殖率，并对褐化的减轻起到了比较明显的作用。韩晶[21]以月光枣为试材开展试验则认为：硝酸银溶液的添加会使得愈伤组织增殖缓慢，褐化严重，总体来说不利于花药愈伤的生长与再生出芽。由于树种不同，硝酸银在花药愈伤诱导效果上表现出很大的差异，间接地反映了基因型在花药培养中的决定性作用。

1.4.5 活性炭和PVP 刘晓光等[22]发现在材料容易褐化的培基中添加适量的活性炭或PVP，可以提高所形成愈伤组织的质量，避免愈伤因褐化而死亡。吴丽萍[13]在冬枣树花药培养中发现，在增殖培养基中添加0.2～0.4 g/L的活性炭，能有效减轻愈伤组织的褐化程度，同时有利于愈伤组织增殖。

2 培养条件

在花药组织培养过程中，培养时的温度和光照也是重要的影响因素。通常离体培养的花药对温度十分敏感[28]。枣树花药组织培养一般分为2个阶段，即光照培养和暗培养，武晓红等[7]发现与光照培养相比，暗培养更有利于枣树花药愈伤组织的发生。王震星等[5]曾指出枣树花药离体培养的所需温度为(26±2)℃，在黑暗条件下诱导愈伤组织；在光照条件下进行分化培养，每日光照12 h，光照强度为2500 lx。这一结论为后来的学者提供了切实可行的指导，并在不断的探索中细化、完善。

3 倍性研究

育种工作的目的是使获得的单倍体植株经过染色体加倍而成为纯合的二倍体可育植株，植物的花粉是由花粉母细胞减数分裂而来，其染色体数为体细胞的一半。理论上讲，由花药培养诱导产生的愈伤组织细胞应为单倍体。但从众多学者的研究结果中可以看出，在诱导产生的愈伤组织中，大多数为二倍体、混倍体，单倍体仅占很少的量，主要是受花药诱导频率和分化成苗率低所限。王震星等[29]对金丝小枣树花药诱导的愈伤组织分化出的绿芽生长点细胞进行倍性检测发现，每一块愈伤组织上都有不同倍性细胞的存在。其中单倍体较少，只占到5%左右，二倍体接近80%，另外也有少量的三倍体和四倍体。愈伤组织分化形成的小植株中单倍体5株，占11.1%；二倍体14株，占31.1%；四倍体4株，占8.9%；各种混倍体22株，占48.9%。陈海媛等[30]认为在花粉培养的愈伤组织阶段，染色体的稳定性较差，单倍体频率低的原因可能是自然加倍和有丝分裂过程不正常所致。在花药培养中还存在着体细胞产生的愈伤组织干扰的情况，比如药壁细胞、药隔细胞或残存花丝细胞等生成的再生植株也不会出现单倍体。

4 枣树组织培养研究展望

4.1 提高单倍体的诱导率

单倍体细胞的自然加倍和有丝分裂过程不正常，以及花药壁细胞的干扰等因素直接导致所获得的单倍体细胞比例较小，而且培养过程中单倍体细胞的生长很容易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖，所以花药组织培养获得单倍体植株较困难。比较有效地提高单倍体诱导率的方法是直接进行花粉培养，排除体细胞干扰。另外，在培养过程中，对何时单倍体细胞所占比例最大、何时扩大繁殖以及分化成苗等问题，还有待进一步研究。

4.2 培养过程充分考虑不同因素的相互作用

在枣树花药培养的众多研究中，研究各种外界因素对花药培养的性状表现居多，基本都建立在经验的基础上，而对引发试材特定性状的特定因素作用机理研究较少，单从性状表现来确定各因素的作用受到客观条件的制约，容易出现偏差，不利于揭示各因素的作用机理。研究过程中需要结合植物生理学层面知识来研究各因素对试材的作用，更全面、更准确地把握因素在花药培养中的作用机理，得出普遍性的规律。另外，花药诱导、分化是众多因素作用的结果，然而在已有的研究中，各个因素之间的相互作用关系还不清楚，交互作用考虑不足，在研究单一因素的影响时，也需要考虑各个因素之间的相互作用，以及交互作用对花药培养的影响等，这些尚有待于加强筛选工作，并找出合适的培养方法，以提高花培效率。

4.3 与基因工程相结合

枣树的花药培养对基因型依赖性较强，部分基因型离体培养不发育，有的发生率太低而没有应用价值。可以依据对花药植株利用目的的不同，选择具有代表性的品种进行花药培养，或者结合遗传机理对花药培养进行基础性研究，使花药培养与基因工程相结合，从根本上解决因基因型导致的花药培养效率低等问题，为枣树花药培养技术的应用开创一个新的局面。

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(责任编辑：曾小军)

Research Progress in Tissue Culture of Chinese Jujube Anther

DUAN Yuan-jie1, LIU Hai-gang1, MENG Fu-xuan1, YANG Yu-jiao1, ZHOU Jun2*

(1. Institute of Tropical Ecological Agricultural Sciences, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yuanmou 651300, China; 2. Faculty of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The tissue culture of Chinese jujube anther was reviewed in this paper. The main factors affecting the efficiency of Chinese jujube anther culture were systematically introduced. In addition, the existent major problems in the research of Chinese jujube anther culture were pointed out, and the prospects of this research were discussed.

Chinese jujube; Anther culture; Influencing factor; Research progress

2016-05-24

云南省科技计划项目“云南高原低纬度高海拔地区鲜食枣优良品种的选育”(2014BB001)。

段元杰(1991─)，男，云南楚雄人，研究实习员，从事果树栽培研究。*通讯作者：周军。

Q943.1

A

1001-8581(2016)11-0047-04