miRNA与缺血性脑卒中关系的研究进展*

田灿辉 综述，周　亮审校

(南方医科大学附属南方医院神经内科，广州 510515)



miRNA与缺血性脑卒中关系的研究进展*

田灿辉 综述，周亮△审校

(南方医科大学附属南方医院神经内科，广州 510515)

[关键词]miRNA；缺血性脑卒中；动脉粥样硬化；细胞凋亡；脑水肿

脑卒中是全球重大公共卫生问题，在世界范围内脑卒中是第二死亡疾病[1]和第三致残疾病[2]，给社会和个人造成了极大负担。在我国，脑卒中已超过心血管疾病成为发病率、病死率和致残率最高的疾病[3]。急性脑卒中构成中，大约80%属于缺血性脑卒中。目前，重组人组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)溶栓治疗是缺血性脑卒中超急性期最有效的治疗手段，但狭窄的时间窗限制了其临床应用。因此，从分子生物学的角度对缺血性脑卒中的发病机制进行深入研究，积极寻找有效的分子标志物和治疗靶点，具有重要的临床价值。

miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码RNA，通过与靶mRNA的非翻译区结合，在转录后水平调节基因表达。基于Sanger miRBase 21.0数据库，目前已发现28 645条miRNA前体序列和35 828条成熟miRNA，共涵盖223个物种，其中在人体中鉴别出1 881条miRNA前体序列和2 588条成熟miRNA。miRNA具有重要的生物学功能，参与调节生长发育、细胞增殖、分化、信号通路、新陈代谢和凋亡[4]。近年来，与缺血性脑卒中相关的miRNA研究取得了一定成果，本文将综合近年来的研究报道，对miRNA与缺血性脑卒中的关系作一综述。

1miRNA的生物合成与作用机制

miRNA的成熟是逐步生物合成的结果。细胞核内编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成原始的miRNA转录本(pri-miRNA)；随后被Drosha/DGCR8微处理器复合体加工形成具有茎环结构的长为60～70个核苷酸的前体miRNA(pre-miRNA)；细胞核内的pre-miRNA通过Ran-GTP依赖的核浆转运蛋白Exportin 5输出到细胞浆，在Dicer酶、Ago蛋白家族及RNA结合蛋白TRBP的共同作用下，产生约20个核苷酸长度的小分子双链miRNA；随后双螺旋解链，其中一条单链迅速被降解，另一条单链(即成熟miRNA)结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上形成miR-RISC复合物，通过与靶mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)完全或不完全配对结合，降解靶mRNA或抑制其翻译，进而发挥调控作用[5]。

2miRNA与缺血性脑卒中

缺血性脑卒中是一种急性起病的局灶性脑供血障碍性疾病，脑局部供血动脉血流灌注减少或完全中断可引发该供血区脑组织崩解破坏，进而导致神经功能缺损。由缺血造成的复杂的级联反应称为“缺血瀑布”。已有大量的研究探索了生理条件和缺血性卒中后循环血和脑组织中miRNA的表达、分布及作用。研究显示，众多miRNA与脑组织发育、分化、生理功能及病变等密切相关，它们与靶基因共同参与炎症、动脉粥样硬化、神经血管再生、脑水肿形成、细胞凋亡、细胞外基质重塑等多种与缺血性卒中相关的病理生理学过程，提示miRNA可能成为缺血性卒中早期诊断的分子标志物和有效的治疗靶标。

3miRNA与缺血性脑卒中细胞和动物实验研究方面进展

神经细胞氧糖剥夺(OGD)模型，即将细胞更换无糖培养基，置于充以氮气和二氧化碳混合气体的低氧环境培养，是在细胞水平模拟脑组织缺血损伤的经典模型[6]。OGD致离体细胞缺血缺氧模型避免了诸多体内因素对实验结果的干扰，便于观察各种刺激的作用及进一步探索其分子生物学机制。

在动物研究方面，进展最迅速的是啮齿类动物全脑或局灶性脑缺血模型。由于临床上大脑中动脉供血区是缺血性脑卒中的多发部位，且大鼠与人类脑血管解剖较为相似，因此阻断大脑中动脉(MCAO)形成的大鼠局灶性脑缺血模型被公认为是一种理想的动物模型。该模型成功率高，制备的缺血部位稳定可靠、重复性好，并能精确控制脑缺血和再灌注时间，因此受到国内外学者的高度重视，并广泛应用于脑缺血的实验研究中。

3.1动脉粥样硬化(AS)途径AS是缺血性脑卒中的主要病理生理基础。业已证实，miRNA可以调节血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞的增殖、分化和功能，进而在AS的发生发展中起重要作用。

Sabatel等[7]研究体外血管生成发现，miRNA-21通过下调RhoB 的表达和活力，使内皮细胞迁移和管腔生成受限，发挥了负性调控血管生成的作用。研究证实，miRNA-92a可阻碍内皮细胞血管生成，抑制miRNA-92a有助于小鼠下肢缺血后的血管再生与功能恢复[8]。Iaconetti 等[9]进一步探讨了miRNA-92a在血管损伤后的重塑作用。他们观察到抑制miRNA-92a可促进内皮细胞的增殖和迁移，体内运用miRNA-92 拮抗剂显著增强小鼠损伤颈动脉的再内皮化，减少球囊损伤或支架植入术后内膜新生，从而减少血管损伤后再狭窄。miRNA-126是一种内皮细胞特异性的miRNA，它通过调节内皮细胞对血管内皮生长因子的应答，下调炎性介质VCAM的表达，进而减少白细胞黏附和内皮炎症反应，延缓AS进程[10]。此外，AS进程中内皮细胞凋亡可引起凋亡小体中miRNA-126释放，它通过促进内皮修复可发挥抗AS的作用[11]。最近的一项研究显示，miRNA-29c通过调节胰岛素样生长因子1信号通路，在人脐静脉内皮细胞周期、增殖、迁移和血管生成方面起到重要的调控作用[12]。

Liu等[13]发现，血管壁中miRNA-221/222的功能是细胞特异性的，在血管平滑肌细胞中，miRNA-221/222具有促增殖、促迁移和抗凋亡的作用，在内皮细胞中其作用刚好相反，这可能与它们作用的靶基因不同有关。miRNA-143/145在平滑肌细胞中表达丰富，是调控其表型的分子开关[14]。缺乏miRNA-143/145的小鼠，其平滑肌维持在一种去分化的状态，严重破坏血管平滑肌的稳态和功能[15]。miRNA-195 是另一种高表达于血管平滑肌细胞的miRNA。研究发现，miRNA-195可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，下调促炎因子的合成，显著减少损伤内膜新生血管形成[16]。Li等[17]研究表明，miRNA-663通过负向调控其下游转录因子Jun B和肌球蛋白轻链9的表达，调控人血管平滑肌细胞表型转化，可作为治疗血管增生性疾病的新靶标。另外，miRNA-23b可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，转录因子FoxO4可能是miRNA-23b的直接靶标[18]。

在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下，单核巨噬细胞吸收脂质并引发炎症反应，是AS发生、发展的关键。在oxLDL刺激的单核巨噬细胞中，miRNA-125a-5p、miRNA-9、miRNA-146a、miRNA-146b-5p、miRNA-155表达升高[19]。miRNAs通过调节相关转录因子信号通路调节巨噬细胞的分化和活力，进而调控AS的进程。

3.2细胞凋亡途径Peng等[20]发现，miRNA-181b在MCAO模型小鼠和OGD模型N2a细胞中表达显著下降，它反向调控热休克蛋白A5和泛素C端水解酶L1的表达并诱导N2a细胞凋亡，下调miRNA-181b可减少MCAO大鼠大脑皮层神经元凋亡并改善神经功能。miRNA-124是重要的促凋亡因子，它可以结合到p53凋亡刺激蛋白家族ASPP抑制因子(iASPP)的3′UTR并抑制其蛋白表达。在MCAO模型小鼠中，注射miRNA-124可抑制颅内iASPP的表达诱导细胞凋亡，反之，下调miRNA-124将刺激iASPP的表达并显著缩小梗塞体积[21]。miRNA-132是一种在神经元中特异表达的miRNA，在突触发生和重构上起关键作用。研究显示，在缺血后的大鼠海马神经元中，REST基因的活化抑制了miRNA-132的表达，miRNA-132过表达可以大大减少缺血引起的神经元死亡[22]。Gubern等[23]研究证实，miRNA-347可引起MCAO大鼠皮质神经元凋亡，它可能通过上调Ascl4、Bnip3l和Phyhip的表达发挥作用。动物实验发现，在缺血后的脑组织中miRNA-592表达下降，相应引起 p75NTR表达上升。上调神经元中miRNA-592表达可抑制缺血损伤引起的p75NTR的表达并抑制凋亡信号通路活化，减少神经元死亡[24]。miRNA-139-5p在大鼠大脑缺血缺氧模型中表达下降，且miRNA-139-5p与HGTD-P的表达呈负相关。miRNA-139-5p激动剂可以抑制神经元凋亡，从而减轻缺血缺氧脑损伤[25]。最近的一项研究显示，卒中后miRNA-200c表达上升，它通过抑制reelin蛋白的表达加剧脑细胞死亡，提示下调卒中后miRNA-200c的表达是减轻卒中引起的脑损伤的潜在靶标[26]。

此外，miRNA-497、miRNA-223、miRNA-29c、miRNA-181a、miRNA-134等也可以通过调节缺血后神经元凋亡起到保护或加剧缺血损伤的作用。

3.3脑水肿损伤途径水通道蛋白(AQP)是控制水进出细胞的一种蛋白质，脑水肿的形成与AQP-1和AQP-4的表达变化密切相关。Sepramaniam 等[27]研究表明，miRNA-320a前体可下调AQP1和AQP4的表达，在MCAO大鼠模型中注射miRNA-320抑制剂，可上调AQP-1和AQP-4在脑组织中的表达，从而缩小脑梗死体积，提示在缺血再灌注早期AQP表达增加可减轻脑水肿。进一步研究证实，miRNA-130a可显著抑制AQP-4 M1基因启动子的转录活性，体内研究发现，抑制miRNA-130a 的表达可上调脑组织中AQP4 M1的转录和蛋白表达，从而减轻脑水肿，缩小梗死体积并促进神经功能恢复。最新的一项研究表明，在MCAO大鼠中，脑组织和循环血中的miRNA-29b的表达均下降。通过促进miRNA-29b的表达可缩小梗死体积、减轻脑水肿并保护血脑屏障的完整性。双荧光素酶检测证实AQP-4是miRNA-29b的直接靶标[28]。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类作用于细胞外基质的蛋白水解酶，研究证实， MMP-9的早期表达与血脑屏障通透性的改变及脑水肿的发生、程度关系密切。miRNA-21和miRNA-181b通过作用于RECK和TIMP3基因调控MMP-9的表达，从而破坏血管基底膜，导致血脑屏障开放，进一步加重脑水肿形成。

4临床试验研究进展

Wang等[28]观察了58例缺血性脑卒中患者，在起病后72 h内收集外周血样本测定RNA水平，并在起病后3个月通过美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)和改良Rankin量表评估疾病的转归和预后。实验结果显示，与对照组相比，miRNA-29b在卒中患者中表达显著下降，循环血中miRNA-29b的含量与卒中患者的NIHSS评分和脑梗死体积呈负相关。miRNA-29b含量高提示患者预后相对较好[28]。Huang等[29]收集了531例缺血性卒中患者，运用TaqMan assay方法研究hsa-miRNA-146a、 hsa-miRNA-196a2和hsa-miRNA-499多态性与中国人群缺血性卒中发病风险的关系。他们观察到，miRNA-146a/rs2910164显著增加中国人群缺血性卒中的发病风险，与空腹血糖和血脂水平共同在卒中的发生、发展中起到重要作用。另外，有一项纳入了31例急性缺血性脑卒中的研究发现，卒中患者中miRNA-124和miRNA-9的表达均下降，卒中起病24 h内血清中miRNA-124和miRNA-9水平与梗死体积和血浆超敏C反应蛋白水平呈负相关，提示它们可能成为预测临床转归和预后的新指标。Wang等[30]对79例缺血性卒中患者进行研究发现，卒中患者循环血中miRNA-223水平明显上升，在大动脉粥样硬化性卒中和小动脉闭塞性卒中升高更显著。其含量与NIHSS评分和梗死体积呈负相关，它可能通过上调生长因子如IGF-1在卒中发生、发展中发挥作用。

5展望

近年来miRNA的研究受到越来越多的重视和关注，也取得了重大进展。随着对miRNA认识的逐步深入，人们对于疾病的发生、发展有了进一步的认识。miRNA作为一类新型的调控分子，已经显示出良好的临床应用前景。它可以作为疾病早期诊断、分型、危险分层等方面的分子标志物，也可以通过补充外源性miRNA或者通过反义抑制寡核苷酸技术调控体内miRNA的表达，为疾病治疗提供新的策略和手段。尽管miRNA与缺血性脑卒中的关系研究取得了一定的成果，但仍有大量问题有待更深入地研究，并以此为基础将miRNA安全而有效地运用到缺血性脑卒中的早期诊断、疾病分型、个体化治疗及预后评估等方面，使更多卒中患者受益。

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doi:·综述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.040

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(NSFC81100882)。

作者简介：田灿辉(1989-)，在读博士，主要从事脑血管病的研究。△通讯作者，Tel:13711529698；E-mail:zhouliang_1963@126.com。

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2276-04

(收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-03-26)