佛手黄酮对高脂血症兔血脂及动脉粥样硬化相关危险因子水平的影响*

龚　正　龚　亮　吕培勇　张金敏,#　 张彩云　董传江　罗　明　张　静

gongzheng119898@163.com



佛手黄酮对高脂血症兔血脂及动脉粥样硬化相关危险因子水平的影响*

龚正1龚亮2吕培勇1张金敏1,#张彩云1董传江1罗明3张静1

gongzheng119898@163.com

【摘要】目的：观察佛手黄酮对高脂血症兔血脂及动脉粥样硬化相关危险因子的作用及机制。方法：28只新西兰兔随机分为四组：对照组、模型组、佛手黄酮组和氟伐他汀组，每组各7只。对照组给予基础饲料喂养，模型组高脂饲料喂养，佛手黄酮组及氟伐他汀组在高脂饲料喂养基础上，分别给予佛手黄酮100mg/kg/天灌胃及氟伐他汀10mg/kg/天灌胃。10周后采用ELISA等测量各组血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平，采用Western blotting检测各组肝组织载脂蛋白E(ApoE)表达水平。 结果：与对照组比较，模型组TC、LDL-C显著升高(P<0.01)，佛手黄酮组TC、LDL-C、MDA、IL-1β水平较模型组显著降低(P<0.05)，NO和肝组织AopE蛋白表达较模型组显著升高(P<0.05)；效果与氟伐他汀组相当(P>0.05)。结论：佛手黄酮具有调节血脂和抗动脉粥样硬化作用。

【关键词】佛手黄酮；血脂；动脉粥样硬化；兔

佛手为芸香科柑橘属植物佛手的干燥果实，是我国道地药材，从佛手果实中提取的佛手黄酮是一类具有还原性质的黄酮类化合物，可抑制炎症介质的释放，具有抗炎作用[1]，已广泛应用于治疗冠心病、循环障碍等[2]。但佛手黄酮影响脂质代谢、调节动脉粥样硬化进程的机制尚未阐明。本实验通过构建新西兰兔高脂血症模型，检测佛手黄酮对其血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肝组织载脂蛋白E(ApoE)水平的影响，分析其抗高脂血症及动脉粥样硬化相关危险因素的作用和可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物和分组处理

28只雄性健康新西兰兔 (湖北省实验动物协会提供，合格证号003004)，购自武汉大学动物实验中心，体重2.0-2.5kg，在宜昌市中心人民医院动物室饲养一周后进行实验。采用随机数字表法将实验动物分为四组，对照组：喂基础饲料(淀粉类64.44%、脂肪14.3%、蛋白质21.06%、丙基硫氧嘧啶0.2%)；模型组：喂高脂饲料(猪油10%、蔗糖20%、鸡蛋10%、标准饲料60%)；佛手黄酮组：喂高脂饲料+佛手黄酮(100mg/kg)；氟伐他汀组：喂高脂饲料+氟伐他汀(10mg/kg)。每组均7只。佛手黄酮组、氟伐他汀组均于每日上午10∶00 左右灌胃给药1次，容量为10ml/kg，对照组和模型组均于每天相同时间灌胃等量生理盐水。连续10周。各组动物分笼饲养，自由饮水，12h光照。

1.2主要药物和试剂

佛手粉剂由三峡大学药理实验室提供，参照文献[3]，采用70%乙醇提取法获取黄酮，并配制成溶液(浓度为10mg/ml)。氟伐他汀胶囊购自黑龙江肇东华富药业集团股份有限公司(20mg/胶囊，批号：H10980227)，取出胶囊中氟伐他汀，用超纯水溶解后，配制成溶液(浓度为1mg/ml)。TC、TG、LDL-C、HDL-C检测试剂盒(批号：080211)和NO检测试剂盒(批号：A013-2)、MDA检测试剂盒(批号：080521)均购自南京建成生物工程研究所；IL-1β试剂盒(批号：ab100577)购自上海蓝基生物公司；蛋白裂解液、PMSF Western blotting等试剂购自美国Sigma公司；内参GAPDH抗体、ApoE抗体、二抗购自美国Cell Signaling公司。

1.3观察指标和检测方法

10周末，各组动物禁食12h(不禁水)，采用20%乌拉坦从耳缘静脉缓慢推注麻醉后，取颈静脉血10ml，3 000r/min离心15min，分离血清，参照试剂盒说明书，采用ELISA检测各组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、MDA和IL-1β浓度之后，采用空气栓塞法处死各组动物，开腹取兔肝组织100mg剪碎后置EP管中，加0.6ml裂解液(裂解液中加入终浓度为100uM的PMSF，匀浆盒提前置入-80℃冰箱5min)，低温30r/s匀浆3min，取出EP管，静置10min，再4℃ 12 000g离心15min。参照文献[4]采用Western blotting检测ApoE 蛋白表达，采用Quantity one软件分析条带灰度值。

1.4统计学处理

2结果

2.1实验动物成模及各组血脂水平

参照文献所行高脂血症造模，模型兔TC 水平高于正常值(1-2mmol/L) 3 倍且TG和LDL-C较对照组升高(P<0.05)，即造模成功[2](表1)。四组兔血清TC和LDL-C水平差异均有统计学意义(F值分别为86.85和13 725.68，P均<0.01)，四组血清TG和HDL-C水平差异无统计学意义(F值为0.63、1.41，P>0.05)。模型组血清TC和LDL-C较对照组显著升高(t值分别为29.83和19.44，P均<0.01)。佛手黄酮组血清TC较模型组显著下降(t值为5.11，P<0.01)，LDL-C与模型组无显著性差异(t值为1.35，P>0.05)。氟伐他汀组血清TC亦较模型组显著下降(t值为5.55，P<0.01)，LDL-C与模型组无明显差异(t值为1.39，P>0.05)。氟伐他汀组TC和LDL-C血清水平与佛手黄酮组差异无统计学意义(t值分别为0.44、0.04，P>0.05)。见表1。

2.2各组血清NO、MDA和IL-1β水平

四组兔血清NO、MDA及IL-1β水平差异均有统计学意义(F值分别为1 083.55、12 450.10和38.66，P均<0.01)。模型组血清NO较对照组显著降低(t值为5.59，P<0.01)，MDA及IL-1β较对照组显著升高(t值分别为40.48和4.07，P均<0.01)。佛手黄酮组血清NO较模型组显著升高(t值为10.86，P<0.01)、MDA及IL-1β水平较模型组显著下降(t值分别为12.67、4.06，P均<0.01)。氟伐他汀组血清NO水平也较模型组升高(t值为10.73，P<0.01)，MDA及IL-1β也较模型组显著下降(t值分别为12.34、4.05，P均<0.01)。佛手黄酮组与氟伐他汀组3指标血清水平差异无统计学意义(t值分别为0.28、0.33、0.01，P>0.05)。见表2。

表1　各组血清血脂水平比较均=7)

注: 与对照组比较,1)P<0.01,与模型组比较,2)P<0.01

表2　各组血清NO、MDA及IL-1β水平比较均=7)

注: 与对照组比较,1)P<0.01, 与模型组比较,2)P<0.01

2.3各组肝组织ApoE蛋白水平

四组兔肝组织ApoE蛋白表达水平(相对表达量)差异均有统计学意义(F值176.40，P<0.01)。模型组肝脏ApoE蛋白表达(2.10±0.30)较对照组(1.00±0.20)显著升高(t值为1.90，P<0.05)；佛手黄酮组(5.80±0.70)较模型组显著升高(t值为3.70，P<0.01)；氟伐他汀组(6.30±0.70)亦较模型组显著升高(t值为4.20，P<0.01)；佛手黄酮组与氟伐他汀组差异无统计学意义(t值为0.50，P>0.05)。见图1。

3讨论

佛手的化学成分主要是酮类、萜烯类、倍半萜烯类等生理活性物质。佛手调节血脂的成分主要为黄酮类及苷类。药理学证实，佛手具有保护高脂血症所致血管内皮细胞损伤、镇痛、抗凝或促凝 (与浓度有关)、促进血液循环、双向调控免疫力等作用。黄酮类物质可降低肠道吸收胆固醇的速率，增加饲喂高脂食物家兔粪便的胆固醇含量， 降低实验性动脉粥样硬化家兔血清胆固醇水平[5]。另有报道[5, 6]，佛手中的不饱和脂肪酸、槲皮素均可降低血脂，防治动脉粥样硬化；6-十一烷醇有降低三酰甘油的作用；β-谷甾醇葡苷可作用于动脉粥样硬化密切相关的多种病理环节。本研究证实佛手中的主要化学成分黄酮可降低高脂血症兔血清TC、LDL-C水平。

注: 与对照组比较, *P<0.05; 与模型组比较,#P<0.01

黄酮类物质可通过抗氧化作用保护血管，发挥抗动脉粥样硬化作用。植物黄酮如淫羊藿总黄酮[7]及动物黄酮如蜂胶黄酮[8]均有抗肝脂质过氧化、增强SOD活性、减少氧自由基生成、降低MDA含量、显著降低脂质化参数、预防和治疗高脂血症等作用。

MDA作为脂质过氧化产物，其大量蓄积可诱发动脉粥样硬化[6]，本研究结果显示，佛手黄酮可降低MDA水平，发挥抗动脉粥样硬化效应。

NO与内皮细胞的氧化应激相关，NO合酶失调可引起NO代谢紊乱，诱发血管损伤及心脏疾病[10]。持续性血浆低浓度NO可导致内皮细胞功能紊乱[7]。有研究证实，麻醉犬静脉注射葛根黄酮，可抑制血管紧张素转换酶活性，降低血管阻力，减轻心脏负荷量，增加脑血流量[12]。此外，黄酮可改善大鼠血液流变学指标，降低血液黏度，促进血液循环[13]。黄酮类化合物可降低血管内皮细胞羟脯酸的代谢，减少血管内壁的胶原或胶原纤维含量，防止血小板黏附、凝集，阻止血栓形成，进而防治动脉粥样硬化[7]。本研究发现佛手黄酮可升高高脂血症兔血清中NO浓度，提示佛手黄酮可保护血管内皮，促进血管舒张功能的恢复，进而拮抗动脉粥样硬化的内皮损伤。

IL-1β是一种促炎因子，主要由巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌。Denes等[8]发现，ApoE基因敲除合并IL-1β受体缺失小鼠，血清IL-1β浓度的升高，加速了动脉粥样硬化形成，使用IL-1β抗体后，动脉炎症减轻。本研究表明，佛手黄酮可降低模型兔炎症性因子IL-1β水平，进而抑制血管损伤，阻断或延缓动脉粥样硬化进程。

ApoE主要由肝脏的实质细胞合成，可以调节脂质代谢过程，维持胆固醇代谢平衡[9]。ApoE基因敲除小鼠可出现动脉粥样硬化加速现象[10]。本研究发现，灌服佛手黄酮后，兔肝脏ApoE蛋白表达升高，提示佛手黄酮可促进肝脏合成ApoE蛋白，降低血脂，进而抑制动脉粥样硬化。

综上， 佛手黄酮可降低高脂血症模型兔血脂水平，并调节高脂血症环境下多种细胞因子及蛋白的表达，具有良好的血管保护作用，可能是动脉粥样硬化临床治疗的一种新选择。

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龚正(1978-)，男，汉族，博士，主治医师，研究方向为高血脂调节

参考文献

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The Effect of Total Flavonoids from Bergamot on Blood Lipid and Atherosclerosis Related Risk Fators in Hyperlipidemia Rabbits

GONG Zheng1, GONG Liang2, LV Pei-yong1, ZHANG Jin-ming1，#, ZHANG Cai-yun1, DONG Chuan-jiang1, LUO Ming3, ZHANG Jing1

1Yichang Center People's Hospital, Yichang 443003;2Department of Clinical Laboratory, Yicheng People's Hospital, Yicheng 441400；3Guangxi Yulin Traditional Chinese Medicine Hospital, Yulin 537000, China;#Corresponding author

【Abstract】Objective: To explore the effect and mechanism of total flavonoids from bergamot on hyperlipidemia and atherosclerosis in rabbits.Method: 28 rabbits were randomly divided into four groups: control group, model group, total flavonoids from bergamot group and fluvastatin group, every group was 7cases. Rabbits in control group were fed with nomal food, the other three groups were fed with high-fat food, and rabbits in the total flavonoids from bergamot and fluvastatin group were intragastricaly administrated with corresponding drug at dose of 100mg/kg and 10mg/kg daily, respectively. After 10 weeks, serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, NO, MDA and IL-1β were deteaed, as well as aopE in liver was tested by Western blotting.Results: Compared with the control group, the levels of TC and LDL-C in model group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the levels of TC, LDL-C、MDA and IL-1β in total flavonoids from bergamot group were significantly decreased (P<0.05), while the NO and the expression of AopE protein in liver tissue were significantly increased (P<0.05), the effect of this group was comparable with the fluvastatin group (P>0.05).Conclusion: Total flavonoids from bergamot can inhibit hyperlipidemia and atherosclerosis.

【Key words】Total flavonoids from bergamot; Blood lipid; Atherosclerosis; Rabbit

作者简介：本文第一

[中图分类号]R543.5R282

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)01-0014-04

*[基金项目]湖北省卫计委科研基金(WJ2015MB173)；宜昌市医疗卫生科研基金(A14301-05) ； 宜昌市中心人民医院科研发展基金(KFJ2013009)

本文2015-06-26收到，2015-12-21修回