浆液性和黏液性卵巢囊腺癌患者线粒体结构和紧密连接蛋白表达的差异比较*

谭树芬　杨宏英　张　芍　祝英杰



浆液性和黏液性卵巢囊腺癌患者线粒体结构和紧密连接蛋白表达的差异比较*

谭树芬杨宏英张芍祝英杰

【摘要】目的：探讨浆液性卵巢囊腺癌(SC)与黏液性卵巢囊腺癌(MC)细胞线粒体结构及紧密连接(TJ)蛋白occludin/ZO-1表达异常的差异及可能机制。方法：临床确诊30例卵巢囊腺癌患者中15例为SC(SC组)，15例为MC(MC组)，另选3例子宫肌瘤患者进行对照(对照组)。采用电镜观察各组线粒体超微结构；采用体视学方法分析线粒体面数密度(Nm)、体密度(Vvm)和外膜面密度(Sv)；采用免疫组化方法检测各组卵巢上皮细胞occludin/ZO-1蛋白的阳性单位(PU)及其强弱程度(用积分光密度值IOD表示)。结果：电镜下，对照组线粒体及内质网均未见异常；MC组线粒体体积小、数量较多，线粒体Nm、Vvm 和Sv较对照组明显降低(P<0.05)；SC组线粒体体积大，脊断裂显著，线粒体Nm、Vvm和Sv较MC组显著升高(P<0.01)。免疫组化分析显示MC组occludin和ZO-1 PU明显高于对照组(24.23±4.74 Vs 21.07±5.51、37.07±3.58 Vs 20.46±4.89，P均<0.05)，IOD明显低于对照组(72.39±9.86 Vs 92.38±7.17、73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P均<0.05)；SC组occludin和ZO-1 PU明显低于对照组(11.50±4.15 Vs 21.07±5.51、16.24±3.61 Vs 20.46 ±4.89，P均 <0.05)，IOD明显高于对照组(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1、92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P均 <0.01)。结论：SC及MC两种卵巢囊腺癌患者线粒体结构和体视学特征明显不同，可能与TJ蛋白的occludin/ZO-1表达异常有关。

【关键词】浆液性卵巢囊腺癌；黏液性卵巢囊腺癌；线粒体超微结构；体视学；紧密连接蛋白

卵巢癌是女性最常见肿瘤之一，约占卵巢恶性上皮肿瘤的90%。肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特性，是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，通常不易被发现，且预后差[1,2]。近年研究显示,紧密连接(Tight Junction,TJ)蛋白是肿瘤细胞黏附、趋化、侵袭及转移的重要物质，主要由跨膜蛋白(occludin)和胞浆附着蛋白(ZO-1)以及细胞骨架蛋白组成，Zhu等[3]研究认为occludin对维持TJ蛋白功能具有重要作用；我们的前期研究[4]发现浆液性卵巢囊腺癌(Serous Ovarian Cystadenocarcinomamucinous,SC)和黏液性卵巢囊腺癌(Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma,MC) 细胞线粒体结构改变明显不同，但这种差异是否与TJ表达异常有关尚不明确。本研究通过体视学原理分析两种肿瘤细胞线粒体三维结构[5]，并采用免疫组化方法检测TJ蛋白occludin/ZO-1的表达变化，比较SC和MC细胞线粒体结构差异及其与occludin/ZO-1表达异常的可能关联，为两种卵巢癌的临床早期诊断寻找新的线索。

1资料与方法

1.1病例和分组

2011-01—2013-12，30例卵巢癌患者在本院行卵巢癌切除术，年龄30-70岁；诊断符合病理学标准，经免疫组化染色确认15例为SC(SC组)，另15例为MC(MC组)；再选3例子宫肌瘤患者作为对照组。

1.2主要试剂和仪器

occludin/ZO-1一抗(鼠抗人抗体)、二抗(抗鼠/兔聚合物)及DAB显色剂(DAB-0031)均购于福州迈新生物技术开发有限公司，苏木素(Hematoxylin)由英国进口分装。超薄切片机(Leica RM2135， 德国)； 日立JEM-1011型电子显微镜(日本)；HPIA-2000高清晰度病理图文分析系统(同济大学)；显微摄影系统(Leica DM4000B，德国)；显微镜摄影软件(Leica IM50，德国)；显微图像分析系统(Nikon-MiVnt，日本)。

1.3线粒体电镜观察及体视学分析

1.3.1电镜观察：取各组卵巢组织块，3.5%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗后，丙酮酸逐级脱水，1%四氧饿酸再固定24h，超薄切片机半薄切片，柠檬酸铅醋酸铀双染色，电镜下观察线粒体形态、结构。

1.3.2体视学分析[4,5]：选择有超微结构改变的卵巢上皮细胞拍照后，采用体视学网格测试系统，以点计数法测量并计算线粒体体密度(Vvm，%)、线粒体外膜表面积密度(Sv,μm-1)、线粒体面数密度(Nm，μm-1)。Vvm= ∑Pmi/∑Ppi；Sv= 4/Z·∑Nmi/∑Ppi；Nm=∑Nmi/a∑Ppi。

1.4occludin和ZO-1免疫组化染色

1.4.1操作方法：采用免疫组化MaxVision快捷法进行occludin/ZO-1检测。操作步骤：常规固定、包埋卵巢组织样本，脱蜡、梯度酒精脱水。将脱蜡水化后组织切片置入已沸腾的缓冲液内加热至工作温度(105℃)和工作压力(90kPa)，喷汽2 min后冲淋冷却以修复组织抗原。3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min ×3次，甩去血清。用PBS(pH 7.4)冲洗3 min ×3次，加50 μl一抗(1∶100稀释);4℃冰箱孵育过夜；除去PBS液，加50 μl酶标抗鼠/兔聚合物(二抗)，室温孵育15 min。PBS冲洗，除去PBS液，加50μl新鲜配制的DAB溶液后镜下观察。自来水冲洗、苏木素复染，0.1% HCl分化；自来水冲洗返蓝。经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.4.2结果判定：所有石蜡切片由病理科医师独立评判后综合评定。occludin 和ZO-1阳性物为细胞浆中有棕黄色细颗粒物，计算阳性单位(PU)：

公式中Gα为待测结构α的平均灰度，GA为含有α的A区域的平均灰度，Gmax为检测仪器的最大灰度，AAα为α相在A区域中的面积密度。

在相同电压及相同亮度条件下，用20倍物镜摄取各组上述切片图像传送至计算机显示屏，采用Nikon-MiVnt显微图像分析系统进行免疫组化图像定量分析，occludin/ZO-1阳性表达的相对强弱用平均灰度值(即积分光密度值，IOD)表示。

1.5统计学处理

2结果

2.1各组线粒体超微结构和体视学变化

2.1.1超微结构： 电镜观察，对照组线粒体及内质网无异常(图1A)。SC组线粒体肿胀、体积明显增大、紧挤于细胞内，呈典型巨线粒体，脊断裂明显(图1B)。MC组线粒体改变以增生为主，体积较小、数量增多(图1C)。

2.1.2体视学变化：三组Nm、Vvm 、Sv差异均具有统计学意义(P<0.05)。MC组线粒体Nm、Vvm和Sv较对照组明显降低(P<0.05，P<0.01)，SC组线粒体Nm、Vvm和Sv较MC组明显升高P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1　各组线粒体Nm、Vvm及Sv比较

注：与对照组比较，1)P<0.05,2)P<0.01；与MC组比较，3)P<0.05,4)P<0.01

2.2各组occludin/ZO-1蛋白表达的PU和IOD

对照组卵巢上皮细胞occludin/ZO-1呈阳性表达，胞浆内有较多棕黄色颗粒物(图2A、图2D)。SC组呈弱表达，癌细胞胞浆内仅见少量棕黄色颗粒物(图2B和图2E)，MC组呈强阳性表达，胞浆内棕黄色颗粒物明显。定量分析表明MC组occludin/ZO-1 PU明显高于对照组(P<0.05)，IOD明显低于对照组(P<0.05)；SC组occludin/ZO-1 PU较MC组明显降低(P<0.01)，IOD较MC组明显升高(P<0.01)。见图 2、表2。

表2　各组卵巢上皮细胞occludin/ZO-1蛋白表达PU及IOD的比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与MC组比较，2)P<0.01

[本文图1、图2见封3]

3讨论

本研究发现，SC组细胞呈巨型线粒体改变及脊断裂，与国外学者关于细胞胀亡(oncosis)的观点相吻合[6]。细胞胀亡作为一种有别于凋亡的细胞死亡方式，在多种疾病的发生发展过程中起重要作用[7]。业已证明，细胞坏死时胞膜的不可逆代谢、功能和结构损伤和完整性消失，造成膜通透性严重缺陷及膜上离子泵功能衰竭引起的细胞水肿及线粒体肿胀，可能是导致SC细胞线粒体Nm、Vvm及Sv明显增加的原因所在[8]；本文SC患者不仅表现为上述体视学参数的显著增加(高于对照组和MC组)，且伴有明显脊断裂，提示线粒体肿胀与嵴破坏可能是卵巢癌后期改变的标志。MC细胞线粒体由于体积较小，因而Nm、Vvm和Sv较对照组降低，其数量较多可能与MC患者机体代谢增强，组织耗氧增加有关[4]。

资料显示，TJ的occludin与相邻细胞通过外环以拉链形式相互结合而产生细胞旁封闭作用，N端对TJ装配和屏障功能保持起重要作用，C端则与ZO-1直接相连，共同调节TJ的结构变化[9]，不仅是TJ的关键组成部分，还控制与上皮瘤形成相关的表型变化[10]；ZO-1既是TJ的装配平台，也是occludin与细胞内骨架连接及信号转导的重要结构[9,10]。有研究将致癌基因Raf-1 转染至Pa-4细胞，导致了TJ功能完全丧失，并引起细胞生长及调控异常以及occludin表达下调和ZO-1分布模式改变[10]。当细胞癌变时，TJ异常可导致细胞极性改变，使细胞之间发生黏附、增殖与分化[11]。本研究中，TJ蛋白occludin和ZO-1在MC组表达增强(高于对照组)，而在SC组表达明显降低，可能反映SC细胞极性破坏，膜通透性增强，也因此提示TJ蛋白可能作为调节因子而抑制肿瘤生长，如Poff 等[12]发现，转染occludin基因进入肿瘤细胞,可影响肿瘤细胞表型,尤其是增加转染肿瘤细胞对凋亡因素的敏感性；抑制occludin也可能作用于TJ，直接或间接参与调节细胞增殖、分化,接收和传授PKC和Rho蛋白质等分子信号,共同抑制肿瘤细胞生长。

综上，SC和MC线粒体超微结构与体视学分析结果存在差异，TJ蛋白的occludin/ZO-1表达也各不相同，初步认为巨线粒体改变的SC细胞TJ表达下调，而线粒体数量增多的MC细胞TJ表达较强，提示SC与MC两种不同类型卵巢癌的病理改变可能与不同的信号转导途径有关，但其临床生物学意义尚需进一步探索。

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谭树芬(1973-)，女，基诺族，学士，副教授，主要从事妇科肿瘤学研究

参考文献

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3Zhu Y,Brnnstrom M, Janson PO,et al. Differences in expression patterns of tight junction proteins,clandin-1,3,4,and 5,in human ovarian surface epithelium as compared to epithelia in inclusion cysts and epithelial ovarian tumoars[J].Int J Cancer, 2006,118(8) :1884-1981.

4谭树芬，卢玉波，杨宏英.卵巢癌VEGF表达及癌细胞线粒体超微结构的改变[J]. 微循环学杂志，2009,19(1):17-19.

5Mumcuoglu EU, Hassanpour R, Perkins G, et al.Computerized detection and segmentation of mitochondria on electron microscope images[J]. J Microscopy, 2012,246(3):248-265.

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8Chen L, Liu T, Tran A, et al.OPA1 Mutation and late-onset cardiomyopathy:mitochondrial dysfunction and mtDNA instability[J].J Am Heart Assoc,2012,1(4):e003012.

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12Poff AM, Ari C, Seyfried TN, et al. The ketogenic diet and hyperbaric oxygen therapy prolong survival in mice with systemic metastatic cancer[J]. PLoS ONE, 2013，8(6): e65522.

Different of Mitochondrial Construction and Expression Abnormity of Tight Junction Protein in the Serous and Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma

TAN Shu-fen ,YANG Hong-ying, ZHANG Shao, ZHU Yin-jie

Department of Obstetrics and Gynecology,The 3rd Affiliated Hospital, Kunming Medical University,Kunming 650018, China

【Abstract】Objective: To investigate the mechanisms and the abnormal differences of mitochondrial construction and the tight junction (TJ) protein occludin/ZO-1 expression in serous ovarian cystadenocarcinoma (SC) and mucinous ovarian cystadenocarcinoma (MC).Method: 30 patients with ovarian cystadenocarcinoma in 15 cases for SC group (SC group), 15 cases of MC (MC), an alternate 3 cases of myoma of uterus controls (control group). The mitochondrial ultrastructure were observed by electron microscope.The number density of mitochondria (Nm), volume density (Vvm) and the outer membrane surface density (Sv) were detected by the stereology analytical method. The ovarian epithelial cell protein positive unit(PU)of occludin/ZO-1 and its power degree (expressed in integral density, IOD) of each group were detected by immunohistochemical method.Results: Under electron microscopy, there were no abnormal mitochondria and endoplasmic reticulum in the control group.Mitochondria of MC group was small in size, quantity was more,the mitochondria Nm, Vvm and Sv significantly lower than the control group (P< 0.05);SC group, mitochondrial volume, spinal fracture significantly, mitochondria Nm, Vvm and Sv MC group significantly increased (P<0.01).Immunohistochemical analysis showed that positive rate of occludin and ZO-1 in MC group was obviously higher than that of control group(24.23±4.74PU Vs 21.07±5.51PU，37.07±3.58PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05)，IOD significantly lower than the control group (72.39±9.86 Vs 92.38±7.17，73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P<0.05).Occludin and ZO - 1 in SC group were significantly lower than the control group(11.50±4.15PU Vs 21.07±5.51PU，16.24±3.61PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05),IOD was significantly higher than the control group(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1，92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P<0.01).Conclusion: The mitochondria stereology characteristics of patients with SC and MC are obviously different,may be related to express abnormalities of occludin/ZO-1 with TJ proteins.

【Key words】Serous ovarian cystadenocarcinoma；Mucinous ovarian cystadenocarcinoma; Mitochondria ultrastructure;Stereology; Tight junctionprotein

作者简介：本文第一

[中图分类号]R730.231

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)01-0010-04

*[基金项目]云南省教育厅科研基金(2010Y184)

[作者单位]昆明医科大学第三附属医院妇瘤科，昆明 650018

本文2015-10-12收到，2016-01-06修回