基于正交设计的不同针刺因素对肾阳虚大鼠HPG轴影响的实验研究*

闵志云，程立红，闵友江△，丁李立强，张 辉，裴 佳

(1.江西中医药大学，南昌 330006;2.江西中医药大学附属医院，南昌 330006)

基于正交设计的不同针刺因素对肾阳虚大鼠HPG轴影响的实验研究*

闵志云1，程立红2，闵友江2△，丁李立强1，张 辉1，裴 佳1

(1.江西中医药大学，南昌 330006;2.江西中医药大学附属医院，南昌 330006)

目的:以皮质酮肾阳虚动物模型为研究对象，采用正交设计研究多个针刺参数，探索影响针刺疗效的主次因素和针刺参数的最佳组合。方法:采用L9(34)正交表对4个参数(穴位、捻针角度、频率、时间)3水平安排试验，运用计算机控制针刺手法仪进行干预，通过ELISA检测血清T、垂体LH的水平和RT-PCR检测下丘脑中GnRH mRNA的表达，以比较上述4个参数的主次及每一参数不同水平的优劣。结果:对针刺疗效的影响由大到小依次为穴位、捻针角度、时间、频率，其中穴位是影响针刺疗效的主要因素，而捻针角度、频率、时间都是次要因素。结论:针刺治疗肾阳虚大鼠的最佳参数为A3B3C2D2，即针刺肾俞、捻针90°、频率120次/min、捻针60 s;本研究中穴位的选择对疗效的影响最大，其次为捻针角度，再次是捻针时间，影响最小的为捻针频率。

正交设计;肾阳虚;T;LH;GnRH

针灸通过扶正祛邪、疏通经络、调和阴阳作用治疗疾病，其扶正祛邪的作用又是通过针灸补虚与泻实的效应来达到。大多学者认为，针灸补虚泻实效应和补泻手法、穴位具有相对特异性与机体的状态、刺激量大小等因素有关［1-4］。而刺激量的大小又与针刺强度(提插捻转频率、捻转角度、提插幅度、针具粗细、针刺深浅)和针刺时间(行针时间、留针时间、针刺次数或疗程、针刺间隔时间)相关［3］。但对于针刺补泻效应与刺激量、穴位具有相对特异性是否相关，针刺刺激量如何做到定量，影响针刺疗效的主次因素，能否获取最佳针刺疗效等多个因素最佳组合等问题目前研究［5-7］还有不足之处。笔者为进一步科学、客观、定量研究针刺疗效与不同针刺因素的关系，故在实验性肾阳虚大鼠模型的基础上，采用L9(34)正交表对影响针刺疗效的4因素(穴位、捻针频率、捻针角度、捻针时间)与3水平安排试验，通过采用计算机控制针刺手法仪对皮质酮肾阳虚大鼠进行针刺疗效影响因素定性定量化实验研究，现阐述如下。

1 材料

1.1 动物

52只清洁级雄性SD大鼠，体质量200～240 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(合格证号SCXK(湘)2011-0003)，标准配方杆状饲料喂养，自由放水。所有大鼠适应性饲养3 d后开始实验，根据《实验针灸学》［8］进行定穴并剪去穴位处毛发。

1.2 试剂与仪器

氢化可的松注射液(5 ml/25 mg)，天津金耀氨基酸有限公司(批准文号国药准字 H12020886); Trizol，invitrogen公司;T、LH酶联免疫检测试剂盒，上海博谷生物科技有限公司;RNaseⅠ，Fermentas公司;SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒，Thermo公司。华佗牌一次性针灸针(30号0.5寸)，苏州医疗器械厂;移液器，吉尔森P型移液器(Pipetman);酶标仪，芬兰(Labsystems Multiskan MS)公司;低温冷冻离心机，Sigma(3K15)公司;针刺手法仪(申请(专利)号 CN200510027586.1，公开(公告)号CN1709215)，上海中医药大学研制;Real-time检测仪，ABI(ABI-7300)公司。

2 方法

2.1 实验干预因素设计

表1显示，因素A(针刺穴位选择):根据前期工作基础，选择肾俞穴治疗肾阳虚证大鼠;选择前三里作为对照穴位之一;非穴区拟选择前三里旁开5 mm处非穴点作为对照穴位之一。

表1 实验干预因素具体设计方案

表2显示，影响针刺疗效的因素有针刺穴位、捻针角度、捻针频率、捻针时间。本实验在皮质酮肾阳虚大鼠模型的基础上对上述4因素3水平采用正交表安排试验。查统计表选择L9(34)正交设计表安排实验。

2.2 造模、分组和治疗方法

2.2.1 分组和造模 52只SD雄性大鼠饲养3 d后按随机数字表法分为2组，正常对照组8例，实验造模组44只。造模方法:每只大鼠按0.03 mg/ (g·bw)剂量肌注氢化可的松，每日1次，连续肌注10 d。肾阳虚大鼠造模成功后，随机分成10组，其中9组为针刺实验组4例，最后1组为模型组8例。

2.2.2 治疗方法 治疗组大鼠用自制固定器捆绑固定，0.5寸30号毫针刺入穴位5～7 mm，进针后稍提插捻转再与针刺手法仪连接，按相应干预因素进行针刺手法操作，留针10 min，再手法操作1次，再留针10 min后出针，共治疗14 d。正常组与模型组大鼠用相同方式固定20 min，不进行针刺操作。

表2 针刺实验组9个亚组实验安排

2.3 指标检测及方法

2.3.1 标本采集 治疗结束第2天处死大鼠。抽取动脉血离心取上清液分装，－20℃冰箱保存备用。断头、咬骨钳去颅骨分离垂体和下丘脑组织，液氮中速冻，－80℃冰箱保存备用。

2.3.2 血清T(睾酮)、垂体LH(促黄体生成素)检测 采用ELISA方法测量其浓度，按照试剂盒说明书进行操作。

2.3.3 下丘脑GnRH(促性腺激素释放激素) mRNA表达检测 采用RT-PCR方法检测，组织总RNA的抽提按Trizol说明书操作。总RNA中DNA的消除、反转录、Real-time PCR扩增、相对mRNA表达水平的计算等操作及方法参考文献［8］，引物的合成与纯化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。GnRH上游引物序列:5'-CGCTGTTGTTCTGTTGAC T-3'，下游引物序列:5'-CTCCTCCTTGCCCATCTC-3'。GAPDH上游引物序列:5'-GCAAGTTCAACG GCACAG-3'，下游引物序列:5'-GCCAGTAGACTCCA CGACAT-3'。

2.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察

造模大鼠体质量减轻，毛发失去光泽，弓背、扎堆、反应迟钝，活动减少，阴囊皱缩，尿量明显增多;经针刺治疗后大鼠食欲增加，体质量加重，活动增加，毛发渐有光泽，而模型组大鼠整体情况不佳。

3.2 血清T、垂体LH和下丘脑GnRH mRNA表达

3.2.1 模型组分别与针刺实验组和正常对照组比较 表3显示，血清 T、垂体 LH和下丘脑GnRH mRNA的表达方面，与正常组比较模型组各指标表达均显著降低(P＜0.01);与模型组比较，针刺实验组大鼠血清 T水平表达明显增加(P＜0.05)，垂体LH与下丘脑GnRH mRNA水平增加更具有统计学意义(P＜0.01)。

表3 各组大鼠血清T、垂体LH和下丘脑GnRH mRNA表达(±s)

表3 各组大鼠血清T、垂体LH和下丘脑GnRH mRNA表达(±s)

注:与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组 别 例数 T(ng/ml) LH(IU/L)GnRH mRNA正常组8 6.62±0.64 10.92±0.81 13.55±1.84针刺实验组 36 5.34±0.951) 10.02±0.932) 8.22±4.212)模型组8 4.35±0.71 8.46±1.25 4.71±1.04

3.2.2 各针刺实验组组间比较 经直观分析，R值越大针刺治疗效果越好。各针刺因素对血清T水平的影响从大到小依次为穴位选择、捻针角度、捻针时间、捻针频率，最佳组合是A3B3C3D2，即针刺肾俞穴，捻针角度90°，频率60次/min，捻针60 s;各针刺因素对垂体组织中LH水平的影响从大到小依次为穴位选择、捻针时间、捻针频率、捻针角度，最佳组合是A2B3C1D1，即针刺前三里穴，捻针角度90°，频率180次/min，捻针120 s;各针刺因素对下丘脑GnRH mRNA表达的影响从大到小依次为:穴位选择、捻针频率、捻针角度、捻针时间，最佳组合是A3B2C2D2，即针刺肾俞穴，捻针角度180°，频率120次/min，捻针60 s(R值见表4)。结合表5各因素对血清T、垂体LH水平和下丘脑中GnRH mRNA表达影响的方差分析结果，即不同针刺因素影响针刺疗效主次的权重和每一针刺因素不同水平优劣的权重，各因素影响针刺疗效从大到小依次是穴位选择、捻针角度、捻针时间、捻针频率，且最佳组合是A3B3C2D2，即针刺肾俞穴，捻针角度90°，频率120次/min，捻针60 s。

表5显示，以血清T、垂体LH的水平和下丘脑中GnRH mRNA的表达为观察对象进行上述4因素3水平间比较的方差分析结果显示，穴位选择对血清T含量、下丘脑中GnRH mRNA表达的影响都是主要因素(P＜0.01和P＜0.01)，对垂体LH含量的影响是重要因素(P＜0.05);捻针角度对血清T、垂体LH含量的影响都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，对下丘脑中GnRH mRNA表达的影响是重要因素(P＜0.05);捻针频率对上述3个指标的影响都属于次要因素(P均＞0.05);捻针时间对血清T、垂体LH含量的影响都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，对下丘脑中GnRH mRNA表达的影响是重要因素(P＜0.05)。根据不同因素主次的权重和每一因素不同水平优劣的权重综合分析(3个指标结果不一致的，以其中的2个一致的结果决定)，穴位选择是影响针刺疗效的主要因素，而捻针角度、频率、时间都是影响针刺疗效的次要因素。

表4 4因素3水平正交实验设计方案及相关指标极差分析

表5 以血清T、垂体LH水平和下丘脑中GnRH mRNA表达为观察指标的针刺多因素方差分析

4 讨论

肾阳虚证是中医的常见证型。皮质酮肾阳虚证模型是实验研究中运用最多且比较成功的动物模型之一。该模型是根据临床肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下而设计的。基于课题组前期研究［10］及按照陈英华等［12］提出评价肾阳虚动物模型从一般状态与实验检测、客观指标、药物反证几个方面进行评价的科学设想，表3实验结果表明，本实验皮质酮肾阳虚证动物模型通过氢化可的松肌肉注射的方法是成功的。

本实验分别以血清T(testosterone，T睾酮)、垂体LH(luteinizing hormone，LH促黄体生成素)的含量 和 下 丘 脑 中 GnRH(gonadotropin-releasing hormone，GnRH促性腺激素释放激素)mRNA的表达作为观察对象进行方差分析，结果表明穴位选择是影响针刺疗效的主要因素。对于肾阳虚证来说，选择肾俞穴的治疗效果要好于前三里和非穴区。笔者曾从背俞穴的意义、穴名释义、古文献、现代神经解剖等方面做过分析［10］。黄成等［13］研究发现，艾灸或针剌老年大鼠“肾俞”能增加其垂体及血清LH、FSH(卵泡生成素)含量，因此认为针灸可使老年大鼠低下的垂体内分泌水平得到恢复。杨廉等［11］研究发现，温针灸肾俞穴具有明显调节性激素的作用，可以使老年雌性大鼠明显低下的E2与孕酮含量升高。而前三里是手阳明大肠经的腧穴，与肾无直接的关系;从现代医学分析，前三里与肾阳虚证的靶腺(肾上腺、甲状腺、性腺)也没有直接联系，而所选择的非穴区更无上述相关联系。因此，通过上述分析与本实验研究结果，腧穴主治作用还是有相对特异性的。

本实验分别以血清T、垂体LH的含量和下丘脑中GnRH mRNA的表达为观察对象进行方差分析，结果表明针刺捻针角度、捻针频率和捻针时间是影响针刺疗效的次要因素。捻针角度、捻针频率和捻针时间是构成针刺刺激量的主要要素之一，但针具的粗细也是构成针刺刺激量的主要要素之一。至于针刺捻针角度、频率、时间在本实验中处于次要因素的可能原因是，体质量200 g大鼠的表面积是70kg人的1/56［10］，30号(直径0.32mm)针灸针作用于大鼠，则相当于一枚直径为2.39mm的钢钉作用于人体，刺激量相当大。当相当于钢钉一样粗细的针刺入到大鼠体内不需要捻针，刺激量在短时间内可能超出取得疗效的刺激量阈值的上限，当再进行捻针时，其捻针的角度、频率、时间所形成的针刺刺激量的累积，大鼠可能已经感受不到了。

本次实验采用的针刺手法仪只能对针刺捻针的角度、频率、时间进行定量控制，笔者曾对该仪器的改进做过设想［14］。但由于软硬件等方面的限制，该针刺手法仪还不能模拟针刺补泻手法，而针刺补泻手法很可能与针刺取穴、捻针角度、捻针频率、捻针时间存在交互作用。由于仪器的原因，针刺补泻手法没有作为独立因素进行研究，这是本实验的不足之处，但也是我们今后努力的方向。

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Experimental Study on the Effect of Acupuncture on Hpg Axis of Kidney Yang Deficiency Rats Based on Orthogonal Design

MIN Zhi-yun1，CHENG Li-hong2，MIN You-jiang2△，DING Li-li-qiang1，ZHANG Hui1，PEI Jia1
(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China; 2.Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China)

Objective:To explore primary＆secondary factors that influences acupuncture effectiveness and the best combination of acupuncture parameters，orthogonal design was adopted to study several acupuncture factors.The rats model of kidney-Yang deficiency made by hydrocortisone as the study objects.Methods:4 influential factors(i.e.selection of acupoints，twisting-rotating angle，twisting-rotating frequency and acupuncture time)plus 3 levels of each factor were arranged to L9(34)orthogonal table.Kidney-Yang deficiency rats were treated by computer controlled acupuncture manipulation device.Serum T and pituitary LH were evaluated by ELISA method and hypothalamic GnRH mRNA expression by real time fluorescent quantitation PCR to illustrate the primary＆secondary factors and the good＆bad of different levels in each factor that could affect the acupuncture effectiveness.Results:Among 4 factors mentioned above，the order for influential factors from major to small was acupoints selection，twisting-rotating angle，acupuncure time and twisting-rotating frequency，among which，selection of acupoints was the major factors，twisting-rotating angle，twistingrotating frequency and acupuncture time all were secondary factors and.Conclusion:The best acupuncture parameters for treating kidney-Yang deficiency rats was combination of A3B3C2D2:selecting Shenshu acupoint(B23)，90°of twistingrotating angle，120tpm of twisting-rotating frequency and 60s of acupuncture time;In this study，selection of acupoints became the biggest influential factor，the next was twisting-rotating angle，the secondary was acupuncture time，and the last one was twisting-rotating frequency.

Orthogonal design;kidney-Yang deficiency;T;LH;GnRH

R245.31

:B

:1006-3250(2016)08-1080-04

2016-02-13

江西省卫计委中医药科研计划项目(2014Z006)(重点课题)-采用正交设计方法研究不同针刺因素对皮质酮肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-性腺轴影响的机制

闵志云(1989-)，男，江西南昌人，在读硕士，从事针灸的临床与研究。

△通讯作者:闵友江(1975-)，男，江西安义人，副教授，副主任医师，医学博士，从事运动系统疾病的针灸治疗与研究，Tel:13177788362，E-mail:myj2002@126.com。