寒凝血瘀证动物模型的建立和优化筛选*

赵珊珊，郝艳玲，袁凤刚，毛承飞，周钦荣，朱红梅△

(1.徐州医学院附属医院，江苏徐州 221006;2.徐州医学院，江苏徐州 221000)

寒凝血瘀证动物模型的建立和优化筛选*

赵珊珊1，郝艳玲2，袁凤刚2，毛承飞1，周钦荣1，朱红梅1△

(1.徐州医学院附属医院，江苏徐州 221006;2.徐州医学院，江苏徐州 221000)

目的:探索不同冷冻时间对造模的影响，为寒凝血瘀证动物模型的制作提供一种优化造模方法。方法:将48只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、寒凝血瘀证3 d组、7 d组、14 d组、20 d组;瘀热互结证组6组各8只，寒凝组大鼠在－20℃持续受冻1 h左右，每日1次，持续时间分别为3、7、14、20 d;瘀热组大鼠采用角叉菜胶联合干酵母悬液造模。结果:与正常对照组比较，寒凝3 d组TSH、ADR显著增加，寒凝7 d组部分血流变学指标、ET显著增加，NO显著降低;寒凝14 d组血流变学指标、ET显著增加，NO、TSH、ADR显著降低;寒凝20 d组血流变指标、ET、NO趋于正常;TSH、ADR显著降低。结论:寒凝血瘀证大鼠最佳冷冻时间为14 d，这样既可保证血瘀证模型成功，同时也符合寒证所具有的机体功能活动衰减的特点。

寒凝血瘀证;瘀热互结证;动物模型

目前，中医证候的动物模型研制长期处于探索性阶段。造模首先应符合中医理论，中医传统辨证的依据是症状、体征、脉象和舌象，这在动物实验中必然存在物种差异、缺少客观量化标准等局限性。因此，判断中医证候动物造模的成功与否，应将中医理论与现代研究成熟的新理论相结合。而现代中医研究成熟的新理论又使得中医证候的诊断标准包涵了一些实验室指标和特殊检查结果。如血液流变学、血浆内皮素(ET)、一氧化氮(NO)等指标的变化与血瘀证有着密切的相关性。在血瘀证形成过程中，气血运行不畅引起微循环障碍，血管舒缩功能和血管内皮受损，其细胞分泌功能失调或紊乱，造成ET分泌增多、NO分泌减少，因而导致血管收缩、血液瘀滞、血细胞聚集、血液呈高凝状态等血瘀的表现。以往多位学者研究发现［1-2］，不同造模方法的血瘀证模型与对照组比较，模型组ET显著升高，NO显著降低。而寒热证与内分泌系统功能的变化或紊乱有密切关系。寒证是机体功能活动衰减所表现的证候，热证是机体功能活动亢盛的反映。血清促甲状腺素(TSH)、肾上腺素(ADR)含量在寒证动物模型中较低，在热证动物模型中较高，差异有统计学意义［3］。

本研究旨在通过观察血流变学指标、NO、ET、TSH、ADR在寒热2种血瘀证动物模型中的变化，揭示不同冷冻时间对寒凝血瘀证动物模型建立的影响，提出寒凝血瘀证动物模型的优化造模方法，为中医证候动物模型研制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

角叉菜胶(Cas No.9000-07-1，上海如吉生物科技发展有限公司);活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，批号QS6540 2801 0001);大鼠内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、肾上腺素(ADR)、促甲状腺素(TSH)酶联免疫分析试剂盒(上海劲马实验设备有限公司，批号JM201504);血流变仪(北京众驰，仪器型号ZL9600C);酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS仪器型号 352型);洗板机(芬兰 Thermo Labsystems仪器型号AC8);国产离心机(微量高速离心机，仪器型号TG16W)。

1.2 动物及分组

清洁级雄性SD大鼠48只，体质量(250±10) g，由徐州医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2010-0011)。将48只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、寒凝血瘀证3 d组、7 d组、14 d组、瘀热互结证组6组各8只。

1.3 造模方法

1.3.1 寒凝血瘀证动物模型 参考文献［4］将造模方法进行优化改良，采用全身冷冻法造模，将雄性SD大鼠各自独立置于罩有铁网罩的小瓷盘上，放入低温冰柜，在－20℃的冷环境中持续受冻1 h左右，待大鼠出现蜷缩少动、反应迟钝、喜扎堆、呼吸微弱、唇周发黑、耳色暗红、爪尾部紫暗、舌暗红、被毛蓬松竖立无光泽、饮水量少、小便色清、大便湿烂等症状时，随即将老鼠脱离冷环境。每日刺激1次，持续刺激时间分别为3、7、14、20 d，末次冷冻结束6 h后收集标本。

1.3.2 瘀热互结证动物模型 参考文献［5］大鼠经腹腔注射角叉菜胶50 mg/kg，每日1次，连续3 d。末次注射24 h后，于大鼠背部皮下注射20%干酵母悬液10mL/kg，6 h后收集标本。

1.4 标本收集及检测

实验结束后，各组动物10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，按血流变、大鼠内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、肾上腺素(ADR)、促甲状腺素(TSH)检测要求处理。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 4.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血流变学指标比较

表1显示，与正常对照组比较，瘀热组血浆黏度、全血高、中、低切黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞变形指数显著增加(P＜0.05);寒凝7 d组血浆黏度、全血低切黏度、红细胞聚集指数、红细胞变形指数显著增加(P＜0.05);寒凝14 d组血浆黏度、全血高、中、低切黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞变形指数显著增加(P＜0.05)。

表1 各组大鼠血流变学指标比较

2.2 各组大鼠ET、NO、ADR、TSH比较

表2显示，与正常对照组比较，瘀热组ET显著增加(P＜0.01)，NO显著降低(P＜0.01)，TSH、ADR显著增加(P＜0.01)。寒凝3 d组TSH、ADR显著增加(P＜0.05)。寒凝7 d组ET显著增加(P＜0.05)，NO显著降低(P＜0.05)。寒凝14 d组ET显著增加(P＜0.01)，NO显著降低(P＜0.05)，TSH、ADR显著降低(P＜0.05)。

表2 各组大鼠ET、NO、ADR、TSH比较

3 讨论

本实验结果发现，与正常对照组比较，瘀热组血流变学指标显著增加，ET显著增加，NO显著降低，TSH、ADR显著增加。而寒凝组造模时间对大鼠血流变、TSH、ADR等指标影响较大，大鼠接受寒冷刺激早期(寒凝3 d组)血流变学指标、ET、NO与正常对照组比较未见明显变化，TSH、ADR变化情况与瘀热组一致，均高于正常对照组，反映大鼠尚处于应激状态。这一点与生理、病理学知识相符即在寒冷环境中，皮肤血管会收缩，同时骨骼肌会不自主收缩，垂体分泌更多地促甲状腺激素作用于甲状腺，使甲状腺分泌的甲状腺激素增加，在甲状腺激素的作用下，机体的新陈代谢活动增强，从而产生更多的热量以御寒。寒凝7 d组可见，部分血流变学指标、ET显著增加，NO显著降低，但TSH、ADR变化与正常对照组比较差异无统计学意义，反映大鼠在寒冷刺激下首先引起微循环障碍，血管舒缩功能和血管内皮受损，其细胞分泌功能失调或紊乱，造成ET分泌增多，NO分泌减少，因而导致血管收缩、血液瘀滞、血细胞聚集、血黏度增加等血瘀表现，而内分泌系统则表现为逐渐适应寒冷环境。寒凝14 d组可见，血流变学指标均显著增加，ET显著增加，NO显著减低，TSH、ADR均显著降低，反映大鼠同时存在微循环障碍以及机体功能活动衰减表现。而寒凝20 d组虽然TSH、ADR亦显著降低，但血流变指标、ET、NO却趋于正常，可能是由于大鼠的适应性反应所致。因而在实验室指标方面，寒凝14 d组最符合寒凝血瘀证模型的特点。此结果与其他方法建立的寒凝血瘀证动物模型在这方面的研究一致［6］。

本实验从现代医学观点出发，通过对比寒热2种血瘀证动物模型的多种实验室指标，揭示其对机体内皮功能、血流变学及内分泌系统的不同影响。同时，在探索寒凝血瘀证动物模型制作方法的过程中，通过实验数据发现，造模时间较短(造模3 d)不仅不会引起血瘀证(内皮功能、血流变学无明显变化)，还可见内分泌系统的应激反应，即呈现瘀热互结证动物模型的变化特点，即TSH、ADR显著增加。造模7 d虽然出现部分血流变学指标、ET、NO的显著异常，但反映寒热性的内分泌系统指标无明显变化。而造模时间过长(造模20 d)，血流变指标、ET、NO却趋于正常。因而本实验研究认为，寒凝血瘀证大鼠最佳冷冻时间为14 d，这样既可保证血瘀证模型的成功，同时也符合寒证所具有的机体功能活动衰减的特点。本实验为寒凝血瘀证动物模型的制作提供了一种优化造模方法，可供研究人员参考。

［1］唐照亮，宋小鸽，章复清，等.艾灸对寒凝血瘀证大鼠血浆内皮素及一氧化氮的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2002，8 (3):57-58.

［2］李兴琴，张俊刚，郝娜，等.2种血瘀证动物模型内皮功能及血液流变学的比较［J］.中国比较医学杂志，2007，17(8):479-480.

［3］李文宏，潘琳娜，等.寒、热证与机体功能活动相关性的初步研究［J］.江西中医学院学报，2011，21(6):59-60.

［4］郑小伟.寒凝血瘀证动物模型的量化研究［J］.浙江中医学院学报，1999，23(2):43-45.

［5］邓家刚，郝二伟，杜正彩，等.中医瘀热互结证大鼠模型的建立及评价［J］.中国中西医结合杂志，2012，32(3):402-405.

［6］谢波，邓海山，喻斌，等.寒凝血瘀证大鼠模型的优化筛选研究［J］.南京中医药大学学报，2013，29(3):262-265.

Establishment and Optimization of Animal Model of Cold Coagulation and Blood Stasis Syndrome

ZHAO Shan-shan1，HAO Yan-ling2，YUAN Feng-gang2，MAO Cheng-fei1，ZHOU Qin-rong1，ZHU Hong-mei1△
(1.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College Jiangsu Xuzhou 221006，China; 2.Xuzhou Medical College，Jiangsu Xuzhou 221000，China)

Objective:Show the effects of different freezing time and provide a new improving method for Blood Stasis due to Cold Syndrome(BSCS).Method:The forty-eight rats were divided randomly into 6 groups:normal control group，BSCS group for 3 d，7 d，14 d，20 d，Blood Stasis and Heat Accumulation Syndrome(BSHAS)group，8 in each.The rats of BSCS group were kept in－20℃ice 1h a day for 3，7，14，20 d.BSHAS group was made by using carrageen and dry yeast suspension.Results:Compared with the normal group，in 3 d of BSCS group，TSH，ADR improved significantly.In 7 d of BSCS group，part of hemorheology indexes and ET improved significantly;NO reduced obviously.In 14 d of BSCS group，hemorheology indexes and ET improved significantly;NO，TSH，ADR reduced obviously.In 20 d of BSCS group，TSH，ADR reduced obviously while hemorheology indexes，ET，NO became normal.Conclusion:The best freezing time for BSCS group is 14d，which can not only ensure the success of the model of blood stasis syndrome，but also has the characteristics of the functional activity attenuation.

Blood Stasis due to Cold Syndrome;Blood Stasis and Heat Accumulation Syndrome;Animal model

R-332

:B

:1006-3250(2016)08-1048-02

2016-02-11

徐州市科技局基金资助项目(KC14SH109)-血塞通、红花黄色素等4种活血化瘀类中药注射液寒热药性的对比性研究

赵珊珊(1981-)，女，江苏徐州人，主治医师，医学硕士，从事中医内科疾病的临床与研究。

△通讯作者:朱红梅(1969-)，女，江苏徐州人，主任医师，医学学士，从事中医内科的临床与研究，Tel:18052268225。