糖肾煎对早期2型糖尿病肾病大鼠足细胞α-actinin-4、ZO-1表达的影响*

胡爱民，晏 玲，张利芳，赵 静，张显林，万巧巧

(1.武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014;2.湖北中医药大学，武汉 430065)

糖肾煎对早期2型糖尿病肾病大鼠足细胞α-actinin-4、ZO-1表达的影响*

胡爱民1，晏 玲1，张利芳1，赵 静1，张显林1，万巧巧2

(1.武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014;2.湖北中医药大学，武汉 430065)

目的:探讨α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)、紧密连接蛋白(ZO-1)在早期糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏表达与DN的关系，中药糖肾煎对保护肾脏的作用机制。方法:采用单肾切除+高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，结合行为干预建立早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病病证结合大鼠模型，按随机数字表法分为假手术组(N组)、模型组(M组)、糖肾煎组(T组)、贝那普利组(B组)。干预16周，观察各组大鼠一般状况、空腹血糖(FBG)、负荷后血糖(P2hBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白(24 h-UAlb)、尿β2微球蛋白(U-β2MG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr))、足细胞密度及病理改变，应用免疫组化及荧光定量PCR方法观察α-actinin-4、ZO-1及mRNA表达。结果:与N组比较，M组一般状况较差，FBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR、24 h-UAlb、U-β2MG水平指标均有明显上升，α-actinin-4、ZO-1的累积光密度值(IOD)下降，PCR表达下降，足细胞密度较少，足突增宽、融合;与M组比较，T、Z组各指标均有改善;与B组比较，T组HOMA-IR、α-actinin-4、ZO-1的IOD有所改善，余指标比较差异无统计学意义。结论:中药糖肾煎能上调足细胞α-actinin-4、ZO-1的表达从而保护足细胞、延缓DN的进展。

2型糖尿病肾病;α-actinin-4;ZO-1;糖肾煎

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，足细胞及其相关蛋白的变化与DN发生发展有密切关系。本研究通过建立DN病证结合模型，从基因水平探讨足细胞α-actinin-4、ZO-1蛋白与DN发生发展关系并研究中药复方糖肾煎对其影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 采用左肾切除+高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，并结合行为干预(饥饱失常、过度疲劳、惊吓)方式，建立早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病大鼠的病证结合模型［1］。采用随机数字表法将SPF级Wistar大鼠分为假手术组(N)、造模组，初步造模成功(腹腔注射STZ72h后剪尾取血行OGTT试验，用强生血糖仪检测血糖，以FBG≥5.6 mmol/L、P2hBG≥7.8 mmol/L为标准)的大鼠再随机分为模型组(M组)、糖肾煎组(T组)、贝那普利组(B组)。T组用糖肾煎(水煮醇提法制备成浸膏，用生理盐水稀释成浓度为2.5 g/ml的溶液)、B组用贝那普利(用生理盐水稀释成浓度为2 mg/ ml的溶液)分别以10 g/kg·d、10 mg/kg·d灌胃，每天1次，连续16周;N组和M组灌等体积饮用水。

1.2 标本采集

实验结束前1周采用金属代谢笼收集24 h尿标本。实验结束前1 d行OGTT试验及胰岛素释放试验。实验结束禁食12～14 h称重，以戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血分离血清备用。取右肾并称重，取部分肾组织分别固定于4%多聚甲醛溶液(光镜标本)和2.5%戊二醛溶液(4℃保存，电镜标本)备用。取部分肾皮质在冰浴条件下制成匀浆氯化钠液，离心取上清液，－20℃保存备用。

1.3 检测方法

FBG、P2hBG用葡萄糖氧化酶法，INS、U-β2MG采用化学发光法，24 h-UAlb用免疫透射比浊法，BUN用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法，Cr用酶法，均严格按试剂盒说明书操作。HOMA-IR=(FBG×FINS)/ 22.5。足细胞相对密度:组织石蜡切片经梯度脱水后行WT1免疫组化染色，光镜400视野下采集图像，运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，采用逐点描绘区域法计算肾小球面积，同时计数肾小球内褐色阳性细胞核即足细胞核个数。足细胞相对密度=足细胞核个数与肾小球面积之比，取其平均值。电镜采用铀铅双染。α-actinin-4、ZO-1免疫组化:组织石蜡切片经梯度脱水后采用DAB染色，每组内每张切片随机挑选3个光镜200倍视野进行拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为阳性统一标准，分析得出每张照片阳性细胞的累积光密度值(IOD)，IOD值越大阳性表达越强，并计算其平均值。荧光定量PCR:总RNA抽提、反转录、定量PCR。扩增条件:预变性95℃，10 min;循环(40次)95℃，15s→60℃，60 s;溶解曲线75℃→95℃，每20 s升温1℃)，ΔΔCT法处理结果(ΔΔCT法:αactinin-4、ZO-1基因相对表达差异用表达倍数=2－K表示)，K=A-B，A=CT(待测样本基因)－CT(βactin)，B=CT(假手术组目的基因)－CT(假手术组β-actin)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料方差齐采用t检验，方差不齐采用t＇检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况

N组大鼠肌肉丰满，毛发洁白顺滑，精神饱满，大便黑褐色颗粒状，舌淡红润泽;M组大鼠消瘦，喜蜷卧或成堆趴卧，少数急躁易怒易惊恐，毛色暗黄无光泽、舌胖大少津等气阴两虚表现明显;T组大鼠上述状况均有明显改善;B组大鼠上述状况有一定程度的改善。

2.2 各组大鼠体质量、FBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR及肾质量/体质量结果比较(表1)

2.3 各组大鼠24 h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及足细胞相对密度结果比较(表2)

表1 各组大鼠体重、FBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR及肾重/体质量结果比较

表2 各组大鼠24 h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及足细胞相对密度结果比较

2.4 电镜下病理改变

图1显示，N组大鼠肾组织结构正常，GBM均匀无增厚，足细胞结构清晰，足突分布均匀且无融合;M组肾小球结构欠清晰，足细胞足突增宽变形、节段性融合，严重者广泛融合;与M组比较，T组和B组GBM轻度增厚，足细胞足突增宽程度较轻，足突部分融合。

2.5 各组大鼠ZO-1、α-actinin-4镜下免疫组化结果

图2显示，N组大鼠肾组织α-actintin-4沿肾小球毛细血管袢呈连续均匀的点线状分布;M组染色强度较N组明显降低;T组、B组染色强度较M组明显增加。

图1 各组大鼠足细胞透射电镜下病理变化(铀铅双染色2500×)

图2 各组大鼠α-actintin-4免疫组化染色(DAB染色200×)

图3显示，N组大鼠肾组织ZO-1沿肾小球毛细血管袢呈连续均匀的点线状分布;M组染色强度较N组明显降低，呈点状、短线状和节段性缺失;T组、B组染色强度较M组明显增加。

2.6 各组大鼠α-actinin-4、ZO-1的IOD值(表3)

表3 各组大鼠α-actinin-4、ZO-1的IOD结果比较

图2 3 各组大鼠ZO-1免疫组化染色(DAB染色 200×)

2.7 各组大鼠α-actinin-4、ZO-1荧光定量PCR (ΔΔCT表示)结果比较(表4)

表4 各组大鼠α-actinin-4、ZO-1荧光定量PCR结果比较

3 讨论

蛋白尿是DN早期的临床表现，也是诊断DN的主要依据［2］。蛋白尿发生发展的机制十分复杂，各种原因导致的肾小球滤过屏障结构及功能的改变是蛋白尿产生的病理生理基础，足细胞结构改变和(或)其分子表达异常与DN蛋白尿产生密切相关。足细胞是终末分化多突状细胞，位于GBM的外侧，由胞体、主足突和次级足突构成，相邻的足突呈并指状相互交错，形成拉链样的结构，称为裂孔膈膜(SD)。α-actinin-4是 actinin(辅肌动蛋白)家族的成员之一，特异表达于肾小球足细胞，具有交联肌动蛋白微丝的功能，可以将松散的肌动蛋白交联成具有收缩能力的纤维束，在保持细胞结构中发挥关键作用［3］。胡光华［4］等综述国内外研究进展认为，病理条件下α-actinin-4表达和分布的异常，一方面影响足细胞SD的正常结构和功能，另一方面干扰纤维状肌动蛋白(F-actin)和整合素 α3β1(integrin α3β1，足细胞贴近GBM侧的跨膜蛋白)二者的平衡，以上2种变化都可能造成F-actin的解聚和重分布，引起足突融合以及与GBM的作用减弱。张路路等［5］体外实验结果表明，高糖刺激后足细胞内αactinin-4的表达下调，并向细胞内部集中，可能刺激足细胞肌动蛋白细胞骨架结构重排。李思佳等［6］

研究表明，α-actinin-4的表达降低参与了DN大鼠蛋白尿的发生。ZO-1是一种在上皮细胞间的紧密连接蛋白，在肾小球上位于SD插入足突处的胞质侧，主要表达在足突上，能与肌动蛋白(actin)细胞骨架相互作用，将SD蛋白连接至actin细胞骨架上，对稳定足突结构非常重要［7］。邹敏书等［8］研究结果表明，DM鼠肾小球ZO-1表达降低，从足细胞膜至胞浆易位并重新分布，导致其他足细胞连接蛋白的改变，使SD从肌动蛋白细胞骨架中分离，蛋白的通透性增加，参与了DN的发病。殷玉红［9］等研究表明，ZO-1在糖尿病肾病发展过程中表达减低，并与足细胞数目呈正相关，ZO-1的表达减低与足细胞数目减少、尿蛋白的发生密切相关。

DN属于中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴。本病基本特点为本虚标实，本虚为气阴两虚，标实为痰热郁瘀［10］。本研究采用笔者临床经验方“糖肾煎”(由生黄芪、太子参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七组成)进行干预，方中重用黄芪为君，益气利水消肿;太子参、山药健脾益气;生地清热凉血、养阴生津;山茱萸补益肝肾;茯苓健脾渗湿、利水消肿;丹皮清热凉血、活血化瘀;三七化瘀止血消肿;五味子补肾益气生津，全方共奏补益脾肾、益气养阴清热、活血通络之功。

本研究中，模型组气阴两虚表现明显，血糖升高，HOMA-IR、24 h-UAlb、U-β2MG升高，肾功能尚正常，符合早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病特点。模型组中α-actinin-4、ZO-1的IOD下降，基因表达下降，与尿蛋白成负相关，表明其与DN的发生发展密切相关。中药糖肾煎干预后血尿生化指标改善，足细胞密度较少程度及足突融合程度较模型组好转，α-actinin-4、ZO-1的IOD增加，基因表达上调，证实糖肾煎能显著减少DN尿蛋白，改善足细胞损伤，对肾脏具有保护作用，其作用机制可能是通过上调足细胞α-actinin-4、ZO-1蛋白的基因表达实现的。

［1］胡爱民，晏玲，张利芳，等.2型糖尿病肾病气阴两虚型动物模型的建立及评价［J］.中国中医基础医学杂志，2015，21 (10):1251-1253.

［2］中华医学会糖尿病学分会.糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)［J］.中华糖尿病杂志，2014，6(11):792-801.

［3］Michaud JL，Chaisson KM，Parks RJ，et al.FSGS-associated alpha actinin-4(K256E)impairs cytoskeletal dynamics in podocytes［J］.Kidney Int，2006，70:1054-1061.

［4］胡光华，刘治民，焦波，等.α-Actinin-4在足细胞脱落机制中的作用［J］.临床医药文献杂志，2015，2(33):6947-6948.

［5］张路路，陈珏，严玉澄，等.高糖环境对小鼠足细胞骨架结构及相关蛋白的影响［J］.上海交通大学学报，2013，33(8): 1050-1054.

［6］李思佳，彭文，王浩，等.糖尿病肾病大鼠肾组织α-actinin-4表达及通络泄浊方的干预作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2011，12(10):856-859.

［7］Gonz ález-Mariscal L，Betanzos A，Avila-Flores A.MAGUK proteins:structure and role in the tight junction［J］.Semin Cell Dev Biol，2000，11(4):315-324.

［8］邹敏书，余健，聂国明，等.1，25-(OH)2D3对糖尿病大鼠ZO-1表达的影响［J］.解放军药学学报，2008，24(1):26-28.

［9］殷玉红，李英.ZO-1在糖尿病大鼠肾组织中的表达及贝那普利的干预作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10(8): 678-682.

［10］中华中医药学会.糖尿病中医防治指南［M］.北京:中国中医药出版社，2007，6:14.

Tangshenjian’Impact on the Early Type 2 Diabetic Nephropathy Rats Podocyte Alpha Actinin-4、ZO-1 Expression

HU Ai-min1，YAN Lin1，ZHANG Li-fang1，ZHAO Jing1，ZHANG Xian-lin1，WAN Qiao-qiao2
(1.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medcine Endocrinology，Hubei Wuhan 430014，China; 2.Hubei University of Traditional Chinese Medcine，Hubei Wuhan 430000，China)

Objective:To investigate the α-actinin-4、ZO-1 in early diabetic nephropathy(DN)in the rat kidney expression and traditional Chinese medicine Tangshenjian on its interventi-on，to study the effect of the renal protective mechanism.Methods:using single renal resection+high-fat+small dose of streptozocin(STZ)intraperitoneal injection，combined with behav-ior intervention，establish early(Qiyin deficiency type)in type 2 diabetic nephropathy ratsmodel，were rando-mly divided into control group(N group)，model group(M)，Tangshenjiangroup(group T)，the Captopril group(group B).Intervention to observe each group for 16weeks general condition，blood and urine of rats biochemical indicators(fasting blood glucose(FBG)，load after blood glucose(P2hBG)，fasting insulin(FINS)，insulin resistance index(HOMA IR)，24Hurinary albumin(24 h-UAlb)，urine β2 microglobulin(U-β2MG)，blood ureanitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，the density of podocyte and pathological changes of thepodocyte undere lectron microscope，immunohistochemical and fluorescence quantitative PCRmethod is appl-ied to observe Alpha auxiliary actin-4(α-actinin-4)、zonula occludens-1(ZO-1)proteinand mRNA expression changes.Results:compared with N group，group Mpoor generalcondition，FBG，P2hBG，FINS，HOMA IR，24 h-UAlb，U-β2MG level indicators aresignificantlyincreased，alpha actinin-4、ZO-1proteinthe cumulative values optical density(IOD)，PCR expression podocytedensity decreased，foot process broadening andfusion;compared with group M，T，each index Z group were improved;compared with group B，group T HOMA IR，α-actinin-4，ZO-1 IOD improved，the index has no obvious difference.Conclusion:Tangshenjian can improvethe early DN rat general condition and related indicators，such as urinary protein，it may be through the podocyte αactinin-4、ZO-1 expression so as to protect the podocyte cell，delay the progress of DN.

Tangshenjian;type 2 diabetic nephropathy;α-actinin-4;ZO-1

R285.5

:B

:1006-3250(2016)08-1050-03

2015-06-24

湖北省卫生计生委资助课题(2013Z-Y36);武汉市2014年“黄鹤英才(医疗卫生)”计划;武汉市卫生局资助课题(武卫(2009)76号)

胡爱民(1960-)，男，主任医师，教授，硕士研究生导师，从事内分泌代谢病的中医药临床与研究。

【实验研究】