曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾功能的保护作用及其机制

杨晓欧，张梦云，冯翔宇，彭玉娟，李秀华

(1 承德医学院附属医院，河北承德067000；2 沧州市人民医院；3 泰安市第一人民医院)



·基础研究·

曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠肾功能的保护作用及其机制

杨晓欧1，张梦云1，冯翔宇2，彭玉娟3，李秀华1

(1 承德医学院附属医院，河北承德067000；2 沧州市人民医院；3 泰安市第一人民医院)

摘要：目的探讨曲美他嗪作为心脏保护药物治疗大鼠慢性心力衰竭(CHF)的同时对肾功能的保护作用及其机制。方法40只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组15只、造模组25只。制作CHF模型后，造模组再随机分为模型组、曲美他嗪组，最终选取假手术组、模型组、曲美他嗪组各10只进行研究。采用多媒体生物信号记录仪记录各组左心室舒张末压(LVEDP)、左心室压力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)；采用 HE及Masson染色方法光镜下观察肾组织的结构变化，免疫组织化学法定性检测各组肾组织血小板源性生长因子-B(PDGF-B)蛋白表达，蛋白印迹法半定量检测各组肾组织PDGF-B 蛋白表达，RT-PCR测定各组肾组织PDGF-B mRNA表达。结果与模型组比较，曲美他嗪组±dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低，PDGF-B 蛋白表达和PDGF-B mRNA水平明显降低(P均<0.01)。结论曲美他嗪在改善CHF大鼠心功能的同时也可能通过抑制PDGF-B的表达对肾功能起到保护作用。

关键词：心力衰竭；肾间质纤维化；曲美他嗪；血小板源性生长因子-B；大鼠

慢性心力衰竭(CHF)是一种复杂的临床症候群，是各种心脏病的终末阶段，患者在心脏泵功能降低的同时往往伴有肾、肺及肝脏功能异常[1]。多项研究证明，心力衰竭患者伴随肾功能不全会明显增加住院率及病死率，且心力衰竭与肾功能不全形成恶性循环，进一步造成心肾功能恶化。因此，在治疗心力衰竭的同时，对肾脏功能保护也不容忽视。2013年9月～2015年6月，我们通过观察曲美他嗪治疗CHF大鼠肾组织血小板源性生长因子-B(PDGF-B)表达的变化，以探讨其对肾脏功能的保护作用及其机制。

1材料与方法

1.1 CHF动物模型制备及分组 清洁雄性Wistar大鼠40只，体质量210～230 g，9～10周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。将大鼠随机分为假手术组15只、造模组25只。各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.15 mL/100 g)麻醉，分层切开腹部，分离出左肾上腹主动脉。假手术组只分离左肾上腹主动脉不结扎，造模组分离左肾上腹主动脉后结扎。各组大鼠术后均给予青霉素20万U连续3 d腹腔注射。术后由于手术应激或天气等因素，假手术组死亡1只，造模组死亡5只。常规喂养4周后，检测心脏血流动力学参数，以左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg作为CHF成模标准。待成功建立模型后，将造模组随机分为模型组与曲美他嗪组，每组10只；假手术组随机选取10只。曲美他嗪组给予曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，模型组和假手术组大鼠给予等量生理盐水灌胃，连续4周。

1.2血流动力学检测 待测大鼠仰卧固定于手术台，腹腔注射3%戊巴比妥钠盐溶液麻醉成功后行颈部正中切口，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端。在结扎处与动脉夹之间剪一小口，向心方向插入导管，松开动脉夹，直至左心室，导管另一端接入压力换能器。在多媒体生物信号记录仪上记录并分析LVEDP、左心室压力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)。

1.3肾脏病理检查 双侧肾脏取材，4%多聚甲醛固定，常规脱水包埋，石蜡标本连续切片制成3 μm厚切片，行HE及Masson染色观察肾组织病理变化。Masson染色结果采用Image-Pro Plus 6．0软件分析，计算胶原纤维面积/所测视野面积比值。每个标本随机选取3个视野进行测定，取平均值。

1.4肾组织PDGF-B 表达检测①免疫组织化学法定性检测各组大鼠肾组织PDGF-B蛋白表达：兔抗大鼠PDGF-B多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，试剂盒购自北京四正柏生物有限公司。PDGF-B一抗工作浓度1∶100，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。PDGF-B阳性信号均为浅黄色至深棕色颗粒，以免疫阳性产物区域面积表示该抗原的相对含量。每个标本随机选取4个视野，进行积分光度(IOD)的测定，取平均值。②蛋白印迹法半定量检测各组大鼠肾组织PDGF-B蛋白表达：称量100 mg肾组织，按照试剂盒步骤提取组织总蛋白，应用BCA蛋白质定量试剂盒测定总蛋白含量，根据蛋白含量计算合适的上样量。取40 μg蛋白样品上样，进行变性、电泳、转膜、封闭、一抗、二抗，ECL化学发光试剂曝光显影，Quantity One软件分析结果，以β-actin表达水平作为内参。③RT-PCR测定各组大鼠肾组织PDGF-B mRNA水平：取100 mg肾组织，用Trizol提取肾组织中总RNA，并测量总RNA的浓度和纯度。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，以PDGF-B与β-actin条带的吸光度比值作为PDGF-B mRNA的表达。

2结果

2.1各组大鼠血流动力学参数比较与假手术组比较，模型组LVEDP明显升高，±dp/dtmax明显降低(P均<0.01)。与模型组比较，曲美他嗪组±dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低(P均<0.01)。

表1　各组大鼠血流动力学指标比较±s)

2.2各组肾脏组织病理变化 HE染色：假手术组肾脏未见明显的组织学变化，肾小球、肾小管结构清晰，排列整齐。模型组肾小管扩张，肾小管上皮细胞水肿，细胞排列紊乱，肾小球结构完整；肾间质增宽，淋巴细胞和单核巨噬细胞灶状浸润。曲美他嗪组肾小管扩张及肾小管上皮细胞水肿减轻，细胞排列较紊乱，肾小球结构完整。Masson染色各组肾小管间质胶原纤维面积及其与视野面积比值见表2。

表2　Masson染色各组肾小管间质胶原纤维面积

注：与假手术组比较，aP<0．01；与模型组比较，bP<0．01。

2.3各组肾组织PDGF-B 表达见表3。

表3　各组大鼠肾组织PDGF-B蛋白及mRNA 表达

注：与假手术组比较,aP<0．01；与模型组比较,bP<0．01。

3讨论

研究表明，心血管疾病往往伴随慢性肾脏疾病，而这两种疾病同时存在使得心血管事件和死亡的发生风险增加4～6倍，心血管疾病的进展可导致肾功能持续性恶化[2]。其中CHF导致肾纤维化的原因如下：① CHF发生时，患者心输出量降低，有效循环血量不足，肾灌注减少，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS系统)。RAAS激活血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及醛固酮的释放，AngⅡ通过蛋白激酶C通路启动细胞内氧化应激，产生大量活性氧自由基，造成肾间质纤维化[3~5]；②CHF发生时，患者静脉压增加，出球小动脉收缩、出球小动脉栓塞等均可使肾小球囊内压增高，而使肾小球囊内压增高是引起肾脏增生性变化的最重要因素[6]。

研究认为，肾间质纤维化的发生以细胞外基质(ECM)的过多沉积为主要特征，在引起ECM沉积的机制中，多种细胞因子如转化生长因子- β、结缔组织因子、PDGF参与了肾间质纤维化的发生发展。其中PDGF家族中 PDGF-B在肾脏纤维化中起着主要的中介作用。有研究证实PDGF-B可促使肌成纤维细胞的形成和Ⅲ型胶原的沉积[7]，从而导致ECM的堆积发展成肾间质纤维化。

本研究证实，曲美他嗪可改善CHF患者的心功能，其机制与其改善心肌代谢[8]、保护心肌细胞线粒体功能有关[9]。Masson染色结果证实，模型组大鼠心力衰竭8周后，发生肾小管间质纤维化，肾小球纤维化不明显；与模型组相比，曲美他嗪组肾小管间质纤维化明显减轻。本研究模型组大鼠PDGF-B蛋白表达及mRNA的表达较假手术组均明显增高，提示PDGF-B在肾间质纤维化中有重要的致病作用；而在曲美他嗪组PDGF-B表达较模型组明显降低，表明曲美他嗪可延缓慢性心力衰竭后引起的肾小管间质纤维化进展，同时也体现了对肾功能的保护作用。曲美他嗪对肾功能的保护作用机制为：①直接或间接抑制PDGF-B的表达，使肾小管间质纤维化延缓；②清除氧自由基和抗氧化活性而抑制氧化应激[10]，从而延缓肾间质纤维化的发展。

综上所述，曲美他嗪治疗慢性心力衰竭时，不仅改善心功能，还可以对肾功能产生保护作用。曲美他嗪对肾功能的保护效应可能通过抑制肾组织中PDGF-B的表达而实现。其具体机制尚需进一步研究。

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(收稿日期：2015-11-15)

中图分类号：R541.6

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.008

通信作者：李秀华(E-mail:lixiuhua76@126.com)

基金项目：河北省卫生计生委资助课题(20110180)。