鼻咽癌CNE1放射抗拒细胞亚系CNE1/70R与亲代细胞的差异

朱玲, 程金建, 许玲玉，杨华

(1广西医科大学，南宁530021； 2广西壮族自治区人民医院)



鼻咽癌CNE1放射抗拒细胞亚系CNE1/70R与亲代细胞的差异

朱玲1, 程金建2, 许玲玉1，杨华1

(1广西医科大学，南宁530021； 2广西壮族自治区人民医院)

摘要：目的探讨鼻咽癌CNE1细胞及放射抗拒细胞亚系CNE1/70R细胞在倍增时间、放射敏感性、药物敏感性、细胞凋亡、细胞周期方面的差异。方法用临床常规分割根治剂量70 Gy体外照射建立鼻咽癌放射抗拒细胞模型CNE1/70R。采用生长曲线检测CNE1及CNE1/70R两株细胞倍增时间，细胞克隆形成实验比较细胞放射敏感性，MTT法检测细胞对药物多西紫杉醇、顺铂的敏感性，流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化。结果CNE1/70R和CNE1细胞的倍增时间分别为(1.612±0.069)、(1.481±0.046)d；与CNE1细胞比较，CNE1/70R细胞的放射抗拒性增强，对化疗药物多西紫杉醇和顺铂敏感性增高；细胞经照射后，CNE1细胞G2/M期阻滞较CNE1/70R细胞更加明显；细胞经照射相同剂量后，CNE1细胞凋亡率高于CNE1/70R细胞。以上观察指标比较，两株细胞差异均有统计学差异(P均<0.05)。结论成功建立人鼻咽癌放射抗拒株CNE1/70R，且与亲代细胞在放射及药物治疗敏感性方面有稳定差异。

关键词：鼻咽肿瘤；放射敏感性；细胞凋亡；细胞周期；多西紫杉醇；顺铂

鼻咽癌是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤。由于其特殊的病理类型、生物学行为和解剖结构，放射治疗(放疗)仍是首选的治疗方法。然而单纯放疗的鼻咽癌患者5年生存率约为 50%，其治疗失败的原因之一是鼻咽癌组织中存在一定比例对放射线有抗拒作用的细胞[1]。目前，国内外已成功地运用辐射诱导建立起放射抗拒的人脑胶质瘤、纤维肉瘤等对比研究模型[2,3],并对这些细胞株作放射抗拒机制的初步研究。2014年8月～2015年11月，我们建立鼻咽癌CNE1细胞及放射抗拒细胞亚系CNE1/70R，为探讨鼻咽癌放射抗拒的分子机制提供理论基础。

1材料与方法

1.1 材料人鼻咽癌CNE1细胞由中科院上海生物学研究所提供，培养于37 ℃、5% CO2含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中。多西紫杉醇、顺铂购于山东齐鲁制药有限公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。细胞凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒购于BD公司。放射源为X射线。用临床常规分割根治剂量70 Gy(6 MV X线，70 Gy/35 d，2 Gy/d，1次/d，5次/周)体外照射建立鼻咽癌放射抗拒细胞模型CNE1/70R。

1.2 绘制细胞生长曲线取CNE1、CNE1/70R对数生长期细胞，胰酶消化，以l×104/mL的密度常规培养于24孔板中，每孔1 mL，每日取其中的3孔用胰酶消化后进行细胞计数。连续观察及计数7 d，重复3次。以培养时间为X轴、细胞数目为Y轴绘制细胞的生长曲线。

1.3照射细胞克隆形成观察取CNE1、CNE1/70R对数生长期的细胞，消化、计数、稀释，分别接种不同数目于6孔板中，根据接种的细胞数分别给0、1、2、3、4、6、8 Gy照射；照射后的细胞继续培养2周，甲醇固定、吉姆萨染色，计数形成的集落数。结果通过Graph pad6.0软件采用单击多靶模型处理，模型方程为SF2=1-(1-e-D/D0)×N。

1.4药物对两组细胞的抑制作用检测 采用MTT比色法。细胞按密度为2×104/mL加入96孔板，每孔200 μL。待细胞长至对数生长期，加入稀释后的多西紫杉醇、顺铂。顺铂浓度为100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，多西紫杉醇浓度为1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L，每个浓度设置3个复孔，每孔总体积200 μL，1个空白对照。细胞培养48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h。吸出上清培养基，每孔再加入DMSO 150 μL，轻微振荡溶解结晶。于490 nm波长进行检测，在酶标仪上检测各孔的吸光度(OD值)。

1.5细胞周期检测采用流式细胞术。将两组细胞接种于6孔板中，分别采用0、8 Gy照射，照射24 h后收集细胞用PBS 洗涤、离心2次，加入PI染色液0.5 mL，冰上避光染色 15 min，上机检测。

1.6细胞凋亡检测采用流式细胞术。取两组对数生长期细胞，接种于6孔板中，分别采用0、4、8、12 Gy照射48 h收集细胞，每样本为1×106/mL。PBS洗涤、离心2次，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL的 PI，避光室温反应15 min，上机检测。

2结果

2.1两组细胞生长曲线细胞接种24 h后已基本贴壁。CNE1/70R细胞生长速度较亲代细胞CNE1慢,CNE1和CNE1/70R细胞的倍增时间分别为 (1.481±0.046)、(1.612±0.069)d,放射抗拒细胞株较亲代延长(P<0.05)。见图1。

图1　CNE1及CNE1/70R细胞的生长曲线

2.2两组细胞克隆形成情况CNE1细胞放射生物学参数D0、Dq、N、SF2 分别为2.930、0.206、1.073、0.482，CNE1/70R细胞分别为2.940、1.084、1.488 、0.612。D0、 Dq、N、SF2越大，放射抗拒性越大， CNE1/70R细胞放射抗拒性增强(P<0.05)。

2.3药物对两组细胞的抑制作用不同浓度多西紫杉醇、顺铂作用细胞48 h 后,多西紫杉醇对CNE1和CNE1/70R细胞的IC50分别为0.049、0.001 μmol/L。顺铂对CNE1和CNE1/70R细胞的IC50分别为1.008、0.337 μg/ mL,CNE1/70R细胞较亲代细胞CNE1对多西紫杉醇和顺铂更加敏感。见表1。

2.4两组细胞周期分布细胞照射后均出现G2/M期阻滞，CNE1 细胞的G2/M期阻滞是CNE1/70R的1.36倍，CNE1/70R细胞的G2/M期阻滞程度低于CNE1细胞。详见表2。

表1　不同浓度多西紫杉醇、顺铂对两组细胞的

注：与CNE1/70R组相同浓度比较,*P<0.05。

表2　CNE1及CNE1/70R细胞经照射后细胞

注：与CNE1/70R组相同照射剂量比较，*P<0.05。

2.5不同照射剂量照射两组细胞凋亡情况CNE1及CNE1/70R细胞分别照射0、4、8、12 Gy，48 h后，随剂量增加，两株细胞凋亡率增加，相同照射剂量下，CNE1/70R细胞凋亡率低于CNE1细胞。详见表3。

表3　不同照射剂量两组细胞凋亡率比较±s)

注：与CNE1/70R组同照射剂量比较,*P<0.05。

3讨论

肿瘤细胞异质性的存在使得同一来源的肿瘤组织细胞表现出多样的生物学特性，同一细胞群中存在放射敏感亚群和抗拒亚群，因此在射线间歇性反复照射过程中，敏感的细胞被射线杀灭，抗拒的细胞则存活并继续增殖，由此筛选出放射抗拒细胞系CNE1/70R。应用集落形成实验对其放射抗拒性进行评价，存活曲线以及相关放射生物学参数D0、Dq、N、SF2均提示CNE1/70R细胞较其亲代细胞更具放射抗拒性。

有研究表明，凋亡与放射敏感性之间具有重要的指示关系。 Mitsubashi等[4]发现,在整个细胞群体中,照射后以凋亡形式死亡的细胞所占比例越大,其放射敏感性越高,这是衡量放射敏感性的重要指标。Broaddus等[5]在实验中将腺病毒介导的wtp53转染至含有mtp53的恶性神经胶质细胞瘤,也显示在辐射敏感性增强的同时细胞凋亡数目显著增多。因此，放射敏感性是影响凋亡至关重要的因素之一。本结果显示CNE1/70R细胞凋亡率低于CNE1细胞，提示着CNE1/70R放射抗拒性较亲代细胞增强。

有研究表明，处在不同细胞周期的细胞对放射的敏感性不同[6，7]。处于 S期的肿瘤细胞对射线最不敏感，G1期较为敏感，而G2期的细胞最为敏感。不敏感细胞比例增加，使得细胞在射线照射时更有可能表现抗拒性[8]。因此改变肿瘤细胞周期可影响肿瘤细胞的放射敏感性[9]，本研究中，射线照射后CNE1/70R细胞G2/M期阻滞程度不如CNE1细胞明显，S期细胞比例相对高于CNE1细胞，提示CNE1/70R细胞较其亲代细胞更具放射抗拒性。

化疗药物主要是通过破坏肿瘤细胞、引起肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。顺铂是一种临床上常用的化疗药物，该药通过将细胞周期阻断在 G2/M 期来杀死肿瘤细胞，其中包括了鼻咽癌细胞。多西紫杉醇是一种新型半合成紫杉醇类衍生物,为有丝分裂抑制剂,可通过促进微管蛋白聚合及抑制解聚,保持微管蛋白稳定,使细胞分裂终止于G2/M期，诱导肿瘤细胞发生凋亡。顺铂、多西紫杉醇对肿瘤细胞的抑制作用与肿瘤细胞 G2/M期阻滞及放疗抵抗的乏氧细胞再氧合[10]有关，细胞内的活性氧达到一定水平后也可导致细胞发生凋亡甚至坏死。因此，通过化疗药物有目的地改变细胞周期, 进而增强放疗敏感性对肿瘤治疗有重要意义。

综上所述，CNE1/70R细胞株与亲代细胞株相比，在放射敏感性和药物敏感性上都存在统计学差异，其放射抗拒机制可能与周期分布改变及细胞凋亡有关。

参考文献：

[1] Pearce AG, Segura TM, Rintala AC, et al. The generation and characterization of a radiation-resistant model system to study radioresistance in human breast cancer cells[J].Radiat Res, 2001,156(1):739-750.

[2] 程金建，胡震，夏云飞，等. 人脑胶质瘤细胞MGR2放射抗拒性的诱导[J].癌症，2006,25(1):45-50.

[3] Wei K, Kodym R, Jin C. Radioresistant cells strain of human fibrosarcoma cells obtained after long-term exposed to X-rays[J]. Radiat Environ Biophys, 1998,37(2):133-137.

[4] Mitsubashi N, Takahashi T, Sakurai M, et al. A radioresistant variant cell line, NMT-1R, isolated from a radiosensitive raryolksac tumor celI 1ine. NTM-1: differences of ear1y, radiation induced morphological changes, especially apoptosis[J]. Int J Radiat Biol, 1996,69(3):329-336.

[5] Broaddus WC, Liu Y, Steele LL, et al. Enhanced radiosensitivity of malignant glioma cells after adenoviral p53 transduction[J]. J N eurosurg, 1999,91 (6):997-1004.

[6] Ree AH, Bratland A, Sloberg Landsverk K, et al, Ionizing radiation inhibits the PLK cell cycle gene in a G2 checkpoint dependent manner[J].Anticancer Res, 2004,24(2B):555-562.

[7] Hill JW, Tansavatdi K, Lockett KL, et al, Validation of the cell G(2)delay assay in assessing ionizing radiation sensitivity and breast cancer risk[J].Cancer Manag Res, 2009,30(1):39-48.

[8] van Bree C, Rodermond HM, ten Cate R, et al. G0cell cycle arrest alone is insufficient for enabling the repair of ionizing radiation induced potentially lethal damage[J]. Radiat Res, 2008,170(2):184-191.

[9] Pawlik TM, Keyomarsi K. Role of cell in mediating sensitivity to radiotherapy [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004,59(4):928-942.

[10] Dunne AL, Mothersill C, Robson T, et al. Radiosensitization of colon cancer cell lines by docetaxel: mechanisms of action[J]. Oncol Res, 2004,14(9):447- 454.

Differences between radioresistant cell subline CNE1/70R of nasopharyngeal carcinoma CNE1 and its parental cell line

ZHULing1,CHENGJinjian,XULingyu,YANGHua

(1GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:Objective To investigate the differences in the doubling time, radiosensitivity, drug sensitivity, apoptosis and cell cycle distribution between nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells and radioresistant cell subline CNE1/70R. MethodsUsing a radical cure dose (70 Gy) of clinical routine segmentation in vitro irradiation to establish radioresistant nasopharyngeal carcinoma cell line model CNE1/70R. The doubling time of the two cell lines CNE1 and CNE1/70R was measured by cell growth curve. The radiobiological characteristics of the two cell lines were analyzed by the colony forming assay. MTT was used to test the drug sensitivity of the two cell lines to docetaxel and cisplatin. The apoptosis and cell cycle was analyzed by flow cytometry. ResultsThe doubling time of CNE1/70R and CNE1R cells was respectively (1.612±0.069) d and (1.481±0.046) d. The result of colony formation assay showed that the radioresistance of CNE1/70R cells was stronger than that of CNE1. Compared with CNE1 cells, CNE1/70R cells were more sensitive to the drugs. After irradiation, the CNE1 cells blocked in the G2/M phase were more than those of CNE1/70R cells, CNE1 arrested more obvious than CNE1/70R. After the same dose of irradiation, the apoptosis rate of CNE1 cells was higher than that of CNE1/70R cells. Significant differences were found in the above indexes between these two cell lines (all P<0.05). ConclusionsWe successfully establish radiaoresistant nasopharyngeal carcinoma cell subline CNE1/70R, and it has stable difference with its parental cell line in radiosensitivity and drug sensitivity.

Key words:nasopharyngeal neoplasms; radiosensitivity; apoptosis; cell cycle; docetaxel; cisplatin

(收稿日期：2015-10-26)

中图分类号：R739.6

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0016-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.006

通信作者简介：杨华(1977-),女，副教授，研究方向为肿瘤药理学和放射生物学，主持省自然科学基金项目研究2项，申请专利1项，发表学术论文多篇。E-mail：yanghuaz@163.com

作者简介：第一朱玲(1992-)，女，在读硕士，研究方向为肿瘤药理学和放射生物学。E-mail：592054762@qq.com

基金项目：广西自然科学基金资助项目(2012GXNSFBA053106)； 国家自然科学基金资助项目(81160284)。