川芎嗪对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用及其机制

史玉，郭永泽，王建华,李校天

(1河北工程大学医学院，河北邯郸056029；2河北工程大学附属医院)



川芎嗪对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用及其机制

史玉1，郭永泽2，王建华2,李校天2

(1河北工程大学医学院，河北邯郸056029；2河北工程大学附属医院)

摘要：目的 探讨川芎嗪(TMP)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠的治疗作用及其机制。方法 采用5%牛磺胆酸钠溶液胰胆管注射诱发SAP大鼠模型。32只大鼠随机分为4组，A组(假手术组)、B组(SAP模型组)、C组、D组，每组8只。C组关腹30 min后腹腔内注射脂多糖(LPS,2 mg/kg体质量)，A、B组在关腹30 min后腹腔内注射与C组相同容积生理盐水，D组关腹30 min后腹腔内注射TMP(10 mg/ 100 g体质量)。干预后6 h，采用鲎试验检测血浆LPS；免疫组织化学法检测胰腺组织内Toll样受体4(TLR4)；荧光分光光度计检测胰腺腺泡细胞内钙离子浓度。结果血LPS水平、胰腺组织TLR4水平、胰腺腺泡细胞钙离子浓度B组均高于A组(P均<0.05)，C组均高于A组及B组(P均<0.05)；与B组相比，D组血LPS水平、胰腺组织TLR4水平、胰腺腺泡细胞内钙离子浓度明显下降(P均<0.05)。结论 TMP可通过干预LPS-TLR4通路缓解SAP大鼠胰腺腺泡细胞内钙超载，从而发挥其治疗作用。

关键词：重症急性胰腺炎；川芎嗪;钙超载；Toll样受体4

重症急性胰腺炎(SAP)病情凶险，病死率30%~40%[1]。目前认为胰腺腺泡细胞损伤促使多种炎性因子的瀑布样释放，引起炎症级联反应[2]，进而加重胰腺损伤。细胞内钙超载是胰腺腺泡细胞损伤的核心事件，调节胰腺细胞内钙离子的动态平衡,防止钙超载是治疗SAP的关键[3，4]。动物和临床试验研究表明，川芎嗪(TMP)可以缓解胰腺腺泡细胞钙超载，对SAP有一定治疗作用。以此为基础，2014年5~12月，我们从细胞和组织水平上，通过对SAP大鼠及胰腺腺泡细胞的研究，探讨TMP延缓腺泡细胞内钙超载的机制。

1材料与方法

1.1材料实验动物:成年健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体质量250～300 g，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。实验过程符合中华人民共和国的《实验动物管理条例》及伦理要求。实验药品及主要试剂：牛磺胆酸钠、LPS购自Sigma 公司；TMP购自中国药品生物制品检定所；内毒素试剂盒购自上海市医学化验所；兔抗TLR4多克隆抗体购自Santa Cruz公司；显色法免疫检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2动物模型制备及分组采用5%牛磺胆酸钠溶液胰胆管注射诱发SAP大鼠模型。具体操作如下：动物用氯胺酮100 mg/ kg体质量腹腔注射麻醉后开腹,暴露胰胆管，在胰胆管出肝门端及肠端用丝线及动脉夹暂阻断, 从近肝门端向胰胆管内加压注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 ml/ 100 g体质量),10 min后去除结扎线及动脉夹。注射后约10 min见胰腺出现肿胀及点状出血坏死，标志造模成功，关腹。假手术组鼠仅做剖腹并轻翻动胰腺。32只模型大鼠随机分为四组：A组(假手术组)、B组(SAP模型组)、C组、D组，每组8只。C组关腹30 min后腹腔内注射脂多糖(LPS，2 mg/kg体质量)，A组、B组在关腹30 min后腹腔内注射与C组相同容积生理盐水，D组关腹30 min后腹腔内注射TMP(10 mg/ 100 g体质量)。干预后6 h，所有动物同批麻醉后，心脏采血备用。取新鲜胰腺组织分离胰腺腺泡细胞。

1.3血浆LPS的检测采用鲎试验动态浊度法。按说明书操作。各组取0.1 mL血浆加入0.9 mL样品处理液中，70 ℃孵育10 min，然后冷却5 min。取上述样品0.2 mL加入酶反应液中混匀，取0.1 mL混悬液加入微孔平板仪，再加0.1 mL鲎试剂混匀，上检测仪器检测。

1.4胰腺组织内TLR4的检测采用免疫组织化学SP法。胰腺组织石蜡切片5 mm，经脱蜡至水、微波抗原修复，加兔抗TLR4多克隆抗体(1∶80)，二抗，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗进行上述染色作为空白对照。切片统一由专门病理医师在光镜下观察，应用图象分析软件计算阳性面积。

1.5胰腺腺泡细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的检测采用荧光分光光度计检测。按胶原酶法分离提纯大鼠原代胰腺腺泡细胞, 制成密度为105~106/L的细胞悬液(经台盼蓝染色测定细胞存活率达90%以上)，在37 ℃的水浴中预温5 min，加入荧光探针Fura-2/AM 37 ℃避光孵育1 h,每隔10分钟振荡1次。染色结束后，用D-Hanks液洗细胞3次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料，用荧光分光光度计检测荧光强度，以340、380 nm双波长激发样品, 发射波长510 nm。[Ca2+]i计算公式:[Ca2+]i=Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)。

2结果

各组血浆LPS、胰腺TLR4阳性面积及腺泡细胞[Ca2+]i比较见表1。

表1　各组血浆LPS、胰腺TLR4阳性面积

注 与A组比较，*P<0.05; 与B组比较,#P<0.05；与C组比较，@P<0.01。

3讨论

临床试验和动物实验研究证实，SAP患者和动物模型的血液中LPS 水平明显升高[5,6]，后者可激活LPS-TLR4 通路，使SAP加重，对胰腺组织造成“二次打击”。目前关于LPS-TLR4 参与SAP发生机制的研究主要集中在其下游细胞因子的炎性作用。其是否还通过其他途径引起胰腺损伤尚未见报道。越来越多的实验结果证实,胰腺腺泡细胞内Ca2+超载是SAP发生发展的“扳机点”。两者之间是否相关、相关性如何目前尚不清楚。本实验结果显示,诱导SAP后,大鼠血浆LPS水平明显升高，胰腺组织TLR4蛋白表达水平明显增加，同时胰腺腺泡细胞[Ca2+]i升高。在此基础上,给SAP大鼠腹腔内注射LPS,可见胰腺组织TLR4蛋白表达水平及腺泡细胞[Ca2+]i升高更明显。说明在SAP发生时, 随着LPS-TLR4 通路的活化，胰腺腺泡细胞[Ca2+]i明显增加,并由此加重了胰腺损伤。

TMP是从中药川穹中分离提纯的生物碱单体，又称四甲基吡嗪。 研究[7，8]发现TMP对SAP大鼠有一定的治疗作用，其可能机制之一是抑制胰腺细胞钙超载[9]。但是其抑制钙超载的相关信号通路未见报道。研究[10]发现TMP具有一定的抗LPS药理作用,对LPS诱导的急性肺损伤大鼠有保护作用[11]。据此,我们推测其可能对LPS-TLR4通路有影响。本试验结果显示，TMP可以降低SAP大鼠血浆LPS含量及胰腺组织TLR4水平，进而缓解腺泡细胞钙超载，这说明TMP可以减轻LPS-TLR4通路诱导的腺泡细胞钙超载。

综上所述，TMP可以通过干预LPS-TLR4通路缓解钙超载，从而发挥其治疗作用，为临床采用TMP治疗SAP提供理论指导。至于LPS-TLR4通路具体通过何种信号分子影响了腺泡细胞内钙信号，需要进一步研究。

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(收稿日期：2015-09-07)

中图分类号：R576

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.011

通信作者：郭永泽(E-mail:guoyongze69@126.com)

基金项目：河北省科学技术厅资助项目(10276105D-49); 邯郸市科学技术技局资助项目(0823108067-2)。