睫状神经营养因子在视网膜疾病中的应用研究进展*

福建医科大学附属第一医院，福建省眼科研究所胡淑琴 徐国兴



睫状神经营养因子在视网膜疾病中的应用研究进展*

福建医科大学附属第一医院，福建省眼科研究所
胡淑琴 徐国兴

[摘要]睫状神经营养因子(CNTF)是视网膜神经保护中被研究最多的因子之一，以往大量的研究证据表明，CNTF对光感受器细胞具有神经保护作用。近期研究则表明其对视网膜色素上皮细胞、视网膜神经节细胞同样具有神经保护作用，并且能提高病理状态下这些视网膜细胞的存活能力。该文就CNTF的基本结构及其在不同视网膜疾病中的研究应用进展等方面进行综述，并展望其在不同视网膜疾病治疗中的应用前景。

[关键词]睫状神经生长因子 视网膜 视网膜色素变性 年龄相关性黄斑变性 青光眼 研究综述

0 引言

许多视网膜相关的疾病如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）以及青光眼等由于特定的视网膜细胞的不可逆性坏死凋亡，造成了永久性的视力丧失。睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)可有效挽救由于各种原因引起的视网膜变性，包括由光感受器或视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE）表达的基因突变，以及由强光照射、神经毒素或抗体导致的视网膜变性；CNTF可以促进视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs）的存活，在视神经挫伤或横断模型中CNTF可以促进视神经轴突生长；此外，CNTF可以影响RPE的生理学特性并能促进其存活。

1 CNTF及其神经保护机制

1.1 CNTF及其受体

CNTF最初是从鸡胚提取物中分离出，由于它能促进鸡胚睫状神经元存活而被命名为睫状神经营养因子。它是由200个酸性氨基酸组成分子质量为22.7kDa的单链多肽，像大多数细胞因子，具有由四个反向平行的α-螺旋束组成的三级结构，属于白细胞介素-6细胞因子家族，该家族成员还包括IL-6、IL-11、白血病抑制因子、心肌营养蛋白-1、心肌营养蛋白样细胞因子和抑癌蛋白M[1]。睫状神经营养因子受体(ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)是由三个亚基 (CNTFR-α、LIFR-β和gpl30)构成的复合体，其中CNTFR-α为CNTF结合蛋白，LIFR-β和gpl30属于细胞因子受体家族成员，存在于细胞膜上，参与JAK／TYK偶联，起信号转导作用。CNTFR-α主要存在于大脑、视网膜和骨骼肌，最近的蛋白质组学分析证实，肠、肾和脂肪细胞上亦可大量表达CNTFR-α。

1.2 CNTF的神经保护机制

同大部分的IL-6家族成员一样，CNTF主要激活JAK/STAT通路，在CNTF发挥作用的经典信号传导途径中，CNTF与其受体亚基结合后再与细胞膜上亚基gpl30和LIFR-β聚合形成受体复合物，使膜内侧的JAK/TYK激酶活化，后者又进一步使gpl30和LIFR-β胞内段的酪氨酸残基磷酸化，为信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3) 提供结合位点，STAT3形成二聚体后迁移至细胞核，进一步调控细胞核内基因转录和蛋白合成[2]。CNTF对神经的保护作用、促进轴突生长和神经元迁移的特性主要由STAT3诱导特异性靶序列的转录介导。CNTF与CNTFR-α相互作用后发挥的神经保护作用被认为是首先活化Muller细胞，之后激发JAK/STAT信号通路介导的[3]，然而，在脊椎动物视网膜，CNTF-α的表达仅限于内层视网膜神经元，特别是视网膜神经节细胞，没有证据表明光感受器细胞的胞体和Muller细胞上有CNTFR-α表达。神经元上CNTFR-α通过GPI锚定于细胞膜上，在某些生理条件下，允许CNTFR-α从胞膜上释放成可溶性CNTFR-α，在视网膜，这种情况主要发生在无长突细胞和水平细胞上。可溶性CNTFR-α能够结合游离CNTF，然后通过gpl30/LIFR-β异二聚体传递信号，从而导致Muller细胞活化介导Jak/ STAT3信号通路活化[4]。

2 CNTF在视网膜疾病中的应用进展

2.1 CNTF在视网膜色素变性中的作用

目前尚无有效的治疗方法可以用于RP，干预性研究证实了用神经营养因子治疗RP的可能性。

CNTF可以有效延缓视网膜色素变性的疾病进程在至少13种不同的动物模型中得到证明[5]。邱晓荣[6]将日龄为10d的12只RP小鼠随机分为CNTF治疗组、磷酸缓冲液（PBS）注射组及空白对照组，CNTF 治疗组小鼠在眼玻璃体腔内注射CNTF，PBS 注射组小鼠在眼玻璃体腔内注射磷酸缓冲液PBS，对空白对照组小鼠不进行任何干预，在三组小鼠日龄14d、18d、22d、30d 时分别为其进行视网膜电图（ERG）检查，结果发现，与CNTF 治疗组相比，PBS注射组小鼠获得暗适应后发生最大混合反应（Max-ERG）、获得明适应后发生 ERG（Cone-ERG）及30Hz闪烁光ERG （Flick-ERG）的a波、b波的振幅均较低且潜伏期较长。CNTF治疗组小鼠出生后第30d为其进行视网膜电图检查仍能记录到a波和b 波。该研究结果表明，在RP小鼠玻璃体腔内注射CNTF能够有效延缓其光感受器细胞的凋亡，使其光感受器细胞功能得到显著提高。CNTF可以有效保护视杆细胞已经在多种RP动物模型中得到证实，Li Y等[7]研究证明，在RP中视锥细胞的退行性变是从外节层开始的，它们在携带视紫红质突变基因的S334ter-3大鼠玻璃体腔内注入重组人CNTF，可以诱导视锥细胞外节层再生，逆转其变性过程，持续性的CNTF治疗可以明显延缓视锥细胞的退行性变。Wen R等[8]研究表明，退化中的视锥细胞仍然能够再生外节层，且再生的视锥细胞外节层可以恢复视锥细胞的感光功能，这对于RP患者来说是非常有意义的，我们可以利用CNTF刺激退行性变中的视锥细胞再生外节层，从而在一定程度上恢复患者的视力。Lipinski DM等[9]研究表明，在CNTF介导的神经保护效果中，剂量是关键因素，而且由腺相关病毒介导的持续hCNTF分泌可以对视网膜变性鼠模型中整个视网膜外层的视锥细胞发挥保护作用，可以保持有效的视力直至视网膜色素变性的终末阶段。此外，转录组分析强烈表明，由Stat3介导的高表达的细胞内和细胞外蛋白酶抑制剂是CNTF治疗RP的基础，细胞内和细胞外蛋白酶抑制剂可能是通过直接抑制细胞内和细胞外基质降解发挥作用，因此，Daniel M等提出介导高表达内源性蛋白酶抑制剂可能成为一种新的治疗RP/AMD等退行性疾病中细胞死亡的新思维。

Sieving PA等[10]完成了一项前瞻性、单中心、非随机的Ⅰ期临床实验，结果证实：10例接受NT-501（一种可以持续分泌CNTF的新型给药装置）植入术的RP患者中，7例患者的视力有不同程度的提高，42.8%（3/7）的CNTF治疗眼的视力可以提高2～3行（用Snellen视力表）并能长期维持在该水平；植入术后6个月时NT-501装置内的细胞数量较植入时略有减少，但仍然能够分泌治疗量的CNTF；所有接受ECT植入患者均未发生眼局部和全身的不良反应，仅有一例患者在植入NT-501时因为手术操作原因导致一过性视力下降和脉络膜浅脱离，经保守药物治疗后病情恢复。该Ⅰ期临床实验表明，玻璃体腔内植入NT-501用于治疗RP的安全性。已完成的随机、多中心、剂量-梯度变化的Ⅱ期临床实验中，以65名晚期RP患者、68名早期RP患者作为研究对象。结果表明：在RP患者眼内持续提供CNTF可以延缓甚至停止RP的病程进展，且无任何严重不良反应的报道[11-12]。Talcott KE等[13]为了研究持续的CNTF治疗对于视锥细胞的结构和功能的影响，进行了一项为期30～35个月的临床实验，他们分别在刚植入NT-501时、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月时用自适应光学扫描激光眼底镜检测视锥细胞之间的距离和密度，用OCT检测视网膜厚度。结果显示：在第24个月时，CNTF治疗眼的外层视网膜厚度明显高于对侧眼（P＜0.005），与治疗眼相比，对照眼中视锥细胞间距每年增加2.9%（P＜0.001），视锥细胞的密度下降9.1%（P=0.002）。该研究结果表明，持续的CNTF治疗可以明显延缓视网膜色素变性中视锥细胞的丢失。

2.2 CNTF在年龄相关性黄斑变性中的作用

AMD以原发的进行性黄斑部光感受器——视网膜色素上皮复合体变性为特点，最终导致不可逆的中心视力散失。Rong Li等[14]研究表明，CNTF可诱导视网膜色素上皮在细胞生物学，生物化学，生理学上发生深刻的变化，包括促进RPE细胞存活、促进其分泌细胞因子/神经营养因子和由JAK/STAT3信号介导的视网膜下腔积液的吸收。在体内，这些变化加在一起可用于调节围绕外层视网膜/RPE/Bruch膜复合体的微环境并且可以提供保护，从而防止退行性疾病的发生。

为了研究眼内植入NT-501用于治疗GA的安全性和有效性，Zhang K等[15]进行了一项随机、多中心，双盲，剂量-梯度变化的Ⅱ期临床实验，为期1年。51名AMD患者被随机分配到接受高剂量CNTF、低剂量CNTF治疗组和空白对照组，最后测量12个月后患者最佳矫正视力的变化。结果显示：96.3%的高剂量治疗组患者可以保持视力稳定（视力损失小于15个字母），而低剂量治疗组和空白对照组分别为83.3%和75%；在高剂量治疗组中最佳矫正视力平均提升0.8个字母，而空白对照组中则平均下降9.7个字母（P=0.0315)；全过程无相关不良反应的发生。该临床实验表明CNTF的治疗效果与剂量有关，持续的CNTF治疗不仅可以在解剖学上使AMD患者的视网膜厚度增加而且功能学上可以使患者的视力得到保护并且有一定的提升，CNTF可以有效延缓GA患者的病程进展。

2.3 CNTF在青光眼中的作用

青光眼的主要特征为病理性高眼压、慢性渐进性视野缺损和RGC死亡，凋亡是青光眼RGC减少的主要原因。目前青光眼的药物和手术治疗，主要用于降低眼压，然而，虽然控制了眼压，大部分青光眼患者的视力仍然不断丧失。因此，迫切需要寻找到可以阻止RGC功能丧失和死亡的方法。研究表明，由于轴突运输受损导致的神经营养因子的缺乏从而导致视网膜神经节细胞的丢失是青光眼视神经病变的一个重要因素[16]，因此有学者把补充神经营养因子作为青光眼视神经病变的治疗策略，以达到保护视网膜神经节细胞及其轴突的目的。青光眼神经保护策略主要是通过直接或者间接保护RGC从而达到预防视神经变性的目的。Flachsbarth K等[17]将经过基因修饰的神经干细胞移植到RGC轴索损伤的小鼠模型的玻璃体中，研究表明，神经干细胞优先分化成星形胶质细胞并可持续表达CNTF，可以显著减少RGC的丢失，并且可以促进受损RGC轴突的再生。魏树瑾等[18]研究表明，在慢性青光眼鼠模型玻璃体中注入CNTF可以延缓鼠慢性青光眼视神经和视功能损伤，STAT3信号转导途径的激活参与此过程。武劲圆等[19]研究表明，在急性高眼压大鼠玻璃体内注入CNTF可以下调谷氨酸在RGC中的表达，从而对RGC提供保护作用。对于CNTF可以减少RGC死亡的机制，研究表明CNTF可以通过激活Muller细胞、星形胶质细胞、RGC上的受体，进而激活STAT3信号通路，以增加体内和体外中RGC存活[20]。

然而临床中神经元损伤的修复，不仅包括解剖学上的再生和重新建立突触连接，更重要的是视觉功能的恢复，因此，在今后关于RGC实验研究中，不仅要注重电生理、解剖学研究，同样也要关注视觉功能的恢复，可以通过观察动物的大脑功能性突触连接及视觉地图重新形成情况评估其视觉功能的情况。

3 细胞包囊技术的应用

传统给药方式的药物生物利用度较低，需要长期连续给药，造成治疗效果不佳。为解决这一问题，美国Neurotech公司研发了一种可以缓慢释放CNTF进入视网膜的一种给药系统即细胞包囊技术（encapsulated cell technology，ECT）。ECT是一种新型的药物输送系统，该装置利用基因修饰视网膜色素上皮细胞使其成为可以持续分泌CNTF的细胞系，然后将该细胞系包装并依附于一种热塑性支持物，封装在半渗透聚合物膜胶囊中[21]。ECT技术作为一种新近研发的给药系统，有其明显的优势。首先，它可以通过基因编码将具有治疗作用的蛋白质工程化至细胞中，使其具有广泛的应用范围；此外，治疗性蛋白是在原位新合成和释放，因此，相对小的蛋白质的量便可以达到治疗效果；蛋白质稳定、内源性分泌确保了该蛋白质在靶位点的可用性不仅是连续，也是长期的；最后，如果需要终止该项治疗，只需取出ECT装置即可。Konrad Pauper等[11]通过一项临床回顾性研究表明NT-501植入物可以在眼内持续产生CNTF超过2年时间，眼内的ECT植入物用于治疗慢性视网膜变性等疾病时具有有利的药代动力学曲线，并且没有明显的毒副作用。基于对受损视网膜的显著和广泛的神经保护作用，以ECT形式发挥作用的CNTF已经在临床试验中进行测试，并经美国食品和药物管理局（FDA）批准可用于治疗RP和地图样萎缩。

4 小结

综上所述，CNTF是一种很有前景的神经营养因子，对于多种视网膜细胞都可提供神经保护作用，尤其是ECT技术的开发更是为CNTF的应用提供了保障。虽然大量的动物实验和临床实验已经证明了CNTF对相关视网膜疾病的治疗作用，但是深入基因学和分子生物学方面的研究可能会产生更大的进步。相信随着对CNTF的不断深入研究，将会对RP、AMD等视网膜疾病患者带来光明的希望。

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* 基金项目:福建省教育厅科研项目( No.JA12139) 。