鱼类血液白细胞的分类计数

徐嘉雯，龙天澄，宁曦，张碧鱼*

（1.中山大学生命科学学院; 2.中山大学海洋科学学院，广东广州510275）



鱼类血液白细胞的分类计数

徐嘉雯1，龙天澄1，宁曦2，张碧鱼1*

（1.中山大学生命科学学院; 2.中山大学海洋科学学院，广东广州510275）

摘要：将三种鱼类的血液涂片，经瑞氏染料染色后，参照哺乳动物白细胞分类的染色标准和特征，能够清楚地显现出类似的嗜中、嗜碱和嗜酸性粒细胞，以及单核细胞和淋巴细胞。鱼类白细胞分类计数的结果，可以反映出鱼体血液功能的变化情况。鱼的种属不同，分类计数也表现出不同。鱼类白细胞的分类计数移植了哺乳动物的血常规方法，只是在取鱼样和使用抗凝剂等技术细节上做了些改进。其技术方法简便可靠，分辨率高，重复性好，可作为一种检测指标，直接应用到鱼类病理生理学研究和水产养殖中。

关键词：鱼类白细胞血液涂片白细胞分类计数

血常规检测，一直是血液生理学中的经典实验，常采用人或其他哺乳动物的血样。但对于普通生物学、生态学和水产科学等专业的本科教学而言，可用鱼血作为血样，移植哺乳动物血常规的实验方法，这样既降低了教学实验的成本，又丰富了实验内容。尤其是鱼类白细胞的分类计数的实验，将其与哺乳动物的白细胞分类计数的实验结果平行对照，有助于理解血细胞的生成、分化和成熟的发育过程；也可作为一种检测指标，应用到鱼类病理生理学、环境胁迫生物学的研究和水产养殖的生产实践中。

动物血液是由血细胞和血浆组成的。血液中的血细胞可划分为红细胞、白细胞和血小板三大类。白细胞（leucocyte）是血液中除红细胞、血小板以外其他多种血细胞的总称，其组织形态特征各异［1，2］。血细胞的计数和分类，常与动物的病理生理状态有关。白细胞分类计数是通过统计血液样本不重复的100个白细胞中不同类别的白细胞数量，确定各类白细胞的组成比例［3］。白细胞比例的任何异常或明显改变，都可能意味着疾病的发生。

鱼类白细胞的形态特征及细胞颗粒对染料的亲和反应与哺乳动物相似，其划分及命名，可采用哺乳动物白细胞分类上所用的方法。即将白细胞分为颗粒白细胞和无颗粒白细胞。颗粒白细胞又分为中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞；无颗粒白细胞包括单核细胞和淋巴细胞［4，5］。

目前可以肯定的是，鱼类外周血液中白细胞的种类、数量及其形态特征存在种属间的差异，鱼类是否存在嗜酸性和嗜碱性粒细胞也有一定的争论［5，6］，染色的方法和分类的标准尚需要统一。本文利用南方市场上常见的三种鱼类的血液样本，开发出鱼类白细胞分类计数的成熟的教学实验提供如下，并对三种鱼类血样的实验结果进行了比较和分析。希望能为血液生物学的教学实验提供参考。

1实验材料与方法

白鲫（Carassius auratus），鲤鱼（Cyprinus carpio），罗非鱼（Oreochromis mossambicus），体重400～600 g，各12尾，1～2龄，不分雌雄。

从鱼尾柄腹面正中进针，于血管棘之间的尾静脉/动脉处取血［4］。用3.2%的柠檬酸钠液作抗凝剂。取血后，血液样本加入盛有抗凝剂（每ml血液样本柠檬酸钠6 mg）的试管中，在室温下静置30 min，待多数红细胞自然沉降后，用尖头吸管紧贴红细胞分层处吸取一滴血液，按常规做血液涂片，每尾鱼的血样做10张涂片。涂片晾干后，用瑞式染料染色（wright染色）。经染色并晾干后的血涂片放在显微镜载物台上，加一小滴香柏油，用光学显微镜的油镜（×100）进行观察，注意显微镜的集光器孔径光栏，要与物镜的数值孔径相匹配。

2实验结果

2.1白细胞染色与形态特征

按照哺乳动物白细胞分类鉴别的方法，在瑞式染色后的血涂片上，各种白细胞清晰可见图1，图2，图3。

嗜中性粒细胞：细胞近圆形，大小与红细胞相差无几（鱼血红细胞呈椭圆形），但在鲤鱼和白鲫中也有一些较大体积的嗜中性粒细胞。与嗜酸或嗜碱性粒细胞比较，胞质中颗粒较小，淡蓝紫色偏红；白鲫和鲤鱼的嗜中性粒细胞胞浆中有较大区域的淡红色，而罗非鱼的嗜中性粒细胞胞浆染色较为均匀，淡蓝紫色，无淡红色区域。细胞核染成很深的蓝紫色，核基本不分叶，也有分成2叶核的，部分细胞核呈肾形或马蹄形。鲤鱼的核分叶的情况较为明显，常见有多叶核的嗜中性粒细胞。没有分叶的细胞核较大，偏于细胞的一侧。

嗜酸性粒细胞：细胞近圆形，体积与嗜中性粒细胞相近或稍大。胞质中粗大的颗粒呈桔红色。核深紫红色，不分叶，偏于细胞一侧。染色较深时，常不能分辩出细胞核。

嗜碱性粒细胞：细胞形状与大小接近其他粒细胞。胞质中颗粒也较为粗大，呈深蓝紫色或蓝褐色。核基本位于细胞中央，不分叶，染紫红色稍浅，也有被胞质遮盖的情形。

单核细胞：细胞多为圆形，体积常大于红细胞和颗粒白细胞，部分细胞轮廓不规则。细胞质呈灰蓝色，胞质中微细颗粒似灰尘状，整体着色较淡，有小的液泡（空泡）和少量的嗜天青颗粒。细胞核较小（尤其是体积比小），偶有呈肾形，染成紫褐色，偏于细胞的一侧。

淋巴细胞：细胞圆形，体积小于其他白细胞，径向约为4~5 μm。胞质很少呈淡蓝色，仅有一薄层围绕在核周围。细胞核呈圆形或卵圆形，细胞核的一侧有时可看到浅的凹痕。核很大，占细胞的大部分，被染成深蓝紫色。白鲫和鲤鱼的血涂片中具有很多小淋巴细胞，大小约为2~3 μm。

图1白鲫的血细胞

图2鲤鱼的血细胞

图3罗非鱼的血细胞

2.2白细胞的分类计数

依据各类白细胞的特征，对观察到的细胞进行分类计数，计算各类白细胞所占的百分比。结果，见表1。

表1鱼血液样本中白细胞的分类计数（±s）

3　讨论

1.瑞式染色后的鱼类血液涂片上，可以按照哺乳动物白细胞分类的标准，将血类白细胞清晰的划分为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。白细胞中又以淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞数量最多，嗜酸性粒细胞数量最少，其单核细胞和嗜碱性粒细胞的比例都高过哺乳动物。

以往的研究认为硬骨鱼类缺乏或仅部分种类具有嗜碱性粒细胞，但在本文的实验中，三种鱼类都具有嗜碱性粒细胞，且比例高过各自血液中的嗜酸性粒细胞。

2.实验用白鲫和鲤鱼在分类上属于鲤形目（Cypriniformes），鲤形目为鱼类中第二大目，其多为淡水鱼；而罗非鱼属鲈形目（Perciformes），鲈形目为鱼类中最大的一个目，其种类多为海水鱼［1］。实验结果表明，白鲫和鲤鱼白细胞染色的特征和分类计数都十分接近。白细胞中淋巴细胞最多，其次是嗜中性粒细胞；嗜中性粒细胞和单核细胞染色的特征也几乎相同（图1、图2）；淋巴细胞中都有许多的小淋巴细胞。但罗非鱼白细胞中却是嗜中性粒细胞居多，尤其是嗜中性粒细胞较少见分叶现象，胞质染色的特征也与白鲫和鲤鱼不同，也几乎没有小淋巴细胞（图1、图2、图3）。由此可见，鱼类白细胞的种类、特征和数量是有种属间的差别。另外实验中也发现，因抽取不成功而多次取血的鲤鱼，其血液中的单核细胞会明显增多。这也意味着白细胞的数量可能与鱼的状态有关。

3.用于鱼类血液的抗凝剂可有多种选择。本文实验中选用3.2%的柠檬酸钠溶液，证明实验效果较好［7］。在实验室常用的抗凝剂中，肝素用于鱼血，其抗凝效果较差；双草酸盐抗凝血的效果较好，但会引起血栓细胞聚集，白细胞形态发生改变［4］；用于哺乳动物的EDTA钠盐（二、乙二胺四乙酸盐），会导致鱼血细胞破裂。

4.哺乳动物白细胞分类计数的方法完全可以移植到鱼类，且操作简捷，分辨率高，结果准确可靠。而哺乳动物血常规检测中的白细胞（含红细胞）的整体计数方法用于鱼类，还有待商榷。

哺乳动物白细胞计数常用的醋酸-龙胆紫稀释液，是不能象林光华等人那样直接用于鱼类血细胞的计数［8，9］。因为对于哺乳动物而言，醋酸作为脂溶剂破坏细胞膜后，红细胞成了“影子”，留下白细胞的细胞核，被龙胆紫染色后，可在显微镜下计数。而鱼类的红细胞是有细胞核的。显然，这样的方法不能满足实验要求。双染料稀释液（中性红＋结晶紫或俾士麦棕＋结晶紫），也常因低倍光学显微镜下，很难区分白细胞与红细胞染色的不同，而导致实验结果不可靠。

尽管鱼类白细胞的分类计数，是否能用来准确地评价鱼类的健康状况、营养状况以及对环境的适应状况，还有待进一步更为深入、广泛的实验研究。但目前看来，白细胞分类计数的方法较为成熟，最有可能成为一种可靠的鱼类生理、病理和毒理学的血常规指标。既使将此方法，用于海洋生物学、水生生物学和水产养殖专业的教学实验，也是一种不错的选择。

参考文献：

［1］张训蒲,朱伟义.普通动物学［M］.北京:中国农业出版社, 2000, 16: 182- 193.

［2］尾崎久雄,著.许学龙,熊国强,缪圣赐,译.鱼类血液与循环生理［M］.上海:上海科学技术出版社, 1982: 55- 66.

［3］林浩然,刘晓春.鱼类生理学实验技术和方法［M］.广州:广东高等教育出版社, 2006: 27- 29.

［4］林浩然.鱼类生理学［M］.广州:广东高等教育出版社, 1999: 82- 85.

［5］陈晓耘.鱼类的血液［J］.重庆师专学报, 2000, 19（3）: 70- 73.

［6］周玉,郭文场,杨振国.鱼类血细胞的研究进展［J］.动物学杂志, 2001, 36（6）: 55- 57.

［7］李玉荣,李双安,武现军,等.不同抗凝剂对鲤鱼血细胞形态的影响［J］.动物学报, 2005, 51（增刊）: 95-99.

［8］林光华,张丰旺,洪一江,等.团头鲂和日本白鲫血液的比较研究［J］.动物学报, 1996, 42（3）: 260-268.

［9］林光华,张丰旺,洪一江,等.二龄鲢和鳙血液的比较研究［J］.水生生物学报, 1998, 22（1）: 9-16.

【责任编辑：邓军文dengjunwen69@126.com】

Differential white blood cell count of fishes

XUJia- wen1, LONGTian- cheng1, NINGXi2, ZHANGBi- yu1
（1.School of Life Science, Sun Yat- Sen University, Guangdong, Guangzhou 510275, China；2. School of Marine Science, Sun Yat- Sen University, Guangdong, Guangzhou 510275, China）

Abstract:Three kinds of fish blood smears are stained with Wright’s staining. Neutrophils, basophils, eosinophils, lymphocytes and monocytes are detected referring to the standard mammalian leukocyte classification and characteristics. The results can reflect the change of fish blood function. If fish species are different, classifying and counting also showdifferent. The method of differential white blood cell count of fishes is same as routine method in mammals, but taking fish’s blood samples and the use of anticoagulants and other technical details make some improvement. The method is simple and reliable, high resolution, good reproducibility. It can be used as a detection index, applied directly to the pathophysiology of fish and aquaculture.

Keywords:fishes white blood cell; blood smear; white blood cell count

*通信作者：张碧鱼（1979-），女，福建漳州人，中山大学助理实验师。

作者简介：徐嘉雯（1991-）,女，广东肇庆人，中山大学博士研究生。

收稿日期：2015-11-23

文章编号：1008- 0171（2016）01- 0023- 04

中图分类号：Q959.4

文献标志码：A