D-乳酸产生菌的研究进展

刘 娟， 王 刚*， 张明磊， 姜兴林， 郭明珠， 陈 光

(1.吉林农业大学 生命科学学院,吉林 长春 130118；2.长春职业技术学院 信息分院，吉林 长春 130118)



D-乳酸产生菌的研究进展

刘 娟1， 王 刚1*， 张明磊1， 姜兴林1， 郭明珠2， 陈 光1

(1.吉林农业大学 生命科学学院,吉林 长春 130118；2.长春职业技术学院 信息分院，吉林 长春 130118)

D-乳酸作为一种重要的工业有机酸，是许多手性物质的中间体，特别是高光学纯度D-乳酸因其可以提高聚乳酸材料的性能而广泛应用。微生物发酵法是目前D-乳酸的主要生产方法，而菌种在发酵生产中占有非常重要的地位，是决定整个生产过程的关键。就近几十年来产D-乳酸常用菌株、菌种进化、研究方法、存在问题及前景做一综述。

D-乳酸; 乳酸菌; 乳酸脱氢酶

乳酸又名α-羟基丙酸、2-羟基丙酸、丙醇酸，分为L-乳酸、D-乳酸，在食品、农业、环保、医药、饲料、日用品、化工等领域具有广泛的用途。近年来，D-乳酸作为许多手性物质的中间体被广泛应用，特别是高光学纯度的D-乳酸，因其可以提高聚乳酸材料的性能而得到越来越多的关注。D-乳酸的合成方法可以分为化学合成法、酶法和发酵法。化学合成法合成效率高，但成本高且毒性大，不适合广泛和可持续生产；酶法可以得到单一旋光乳酸但工艺复杂，成本较高，尚未大规模应用于工业；发酵法生产条件温和，对环境污染小，几乎无毒副作用，是合成D-乳酸的理想方法。我国的D-乳酸生产量远远不能满足工业的需要，生产技术相对落后，尤其是对D-乳酸生产菌研究相对落后，因此，高光学纯度D-乳酸生产菌株的选育及开发是非常重要的。D-乳酸的发酵菌种种类繁多，其中以芽胞乳杆菌、乳杆菌和基因工程大肠埃希菌为主，本文就D-乳酸发酵细菌菌种近几十年的研究进展进行回顾分析，并展望了菌种选育的发展方向。

1 芽胞乳杆菌

芽胞乳杆菌是兼性厌氧菌，通过同型发酵葡萄糖、果糖和甘露糖等产D-乳酸，在产D-乳酸方面应用广泛。丁子建等[1]在国内首次提出利用发酵法生产D-乳酸，研究了温度、含氧量、pH、碳氮源、维生素和金属离子等对芽胞乳杆菌产D-乳酸的影响，D-乳酸光学纯度为96.04%，产量为40.7 g/L。Zhao等[2]应用菊糖芽胞乳杆菌 Y2-8在纤维素固定床生物反应器中以玉米粉水解液进行发酵生产D-乳酸，分批发酵产率可达1.62 g/(L·h)，高于游离细胞发酵，D-乳酸光学纯度在99%以上。Nguyen等[3]开展了乳杆菌、棒杆菌以鲜薯同步糖化发酵生产D-乳酸和L-乳酸的研究。

1.1 芽胞乳杆菌的物理、化学诱变育种

微生物菌种的物理、化学诱变应用范围广，操作方法简单，但突变范围大、不定向，需从大量的突变体中筛选出目的菌株，工作量较大。Zheng等[4]利用原生质体融合技术提高菊糖芽胞乳杆菌ATCC 15538的D-乳酸产量，对起始菌株进行紫外诱变、硫酸二乙酯诱变和pH梯度筛选，经过3轮的基因组重排得到重组菌株F3-4，其在5 L发酵罐中D-乳酸产量达到93.4 g/L，比起始菌株增加了39.8%。于培星等[5-6]以凝结芽胞杆菌JD-063D为出发菌株，利用紫外线、钴60γ-射线辐照、硫酸二乙酯、微波进行复合诱变，使凝结芽胞杆菌产酸量由61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸纯度由97.5%增加到98.7%以上。李银镝[7]利用浓度为0.015%的溴甲酚紫作为筛选剂，以菊糖芽胞乳杆菌SP-BME 126为出发菌株，经过3轮紫外诱变，筛选出D-乳酸高产菌株SP-MD1，与出发菌株相比D-乳酸的产量提高了7.1%，而且稳定性良好。刘联杰等[8]对菊糖芽胞乳杆菌DO进行20 s的紫外及硫酸二乙酯(DES)诱变，得到突变株的D-乳酸产量为61.35 g/L，比出发菌株的42.57 g/L提高了44.1%，而且遗传性状稳定。郑璐等[9]以芽胞乳杆菌Y2-8为出发菌株，采用常压室温等离子体(ARTP)技术对其进行诱变,诱变过程中采用高纯氦气作为工作气体，通气量10 L/min，功率100 W，照射距离2 mm，菌液10 μL。诱变后利用高糖-溴甲酚绿高通量筛选平板复筛，最终筛选得到1株遗传稳定性良好而且产酸速率高的突变菌株Y90s-1，D-乳酸发酵速率达1.05 g/(L·h)，比出发菌株提高了36.3%。

1.2 芽胞乳杆菌的基因工程育种

近几年利用分子手段改造菌株迅速发展，其定向性强，可大量扩增出目的产物的基因，定向改造菌株。胡媛等[10-11]以枯草芽胞杆菌基因组DNA为模板，扩增出葡萄糖脱氢酶基因(gdh)，与表达载体pETduet-1连接得到pETduet-GDH。再以粘质沙雷氏菌基因组DNA为模板，扩增出乳酸脱氢酶基因(ldh)，与已构建的pETduet-GDH连接获得pETduet-LG，转化进入E.coliBL21进行共表达。重组大肠埃希菌可以还原丙酮酸生成D-乳酸。底物转化率达到86.5%，D-乳酸产量为17.3 g/L。郑辉杰[12]以菊糖芽胞乳杆菌SP-BME126 为出发菌株，通过紫外、硫酸二乙酯(DES)诱变和 pH 梯度筛选3种方法，筛选出遗传稳定性较好的菌株。再利用响应面实验得到原生质体的优化条件，在 RSM 优化工艺条件下得到原生质体，原生质体通过3轮基因重排、pH优化、单因素实验、PB实验和中心组合实验对菌种的发酵条件进行优化，最终菌株最大D-乳酸产量达到91.7 g/L。

2 大肠埃希菌

大肠埃希菌是生物领域最常使用的工程菌株之一，是模式菌株，其基因序列研究得比较清楚，基因组序列已全部测出。在生物基因工程领域常被应用于基因的克隆和载体的构建。孟武等[13]克隆大肠埃希菌E.coliW3110菌株中的4个代谢木糖的关键基因：木酮糖激酶基因(xylB)、木糖异构酶基因(xylA)、转醛醇酶基因(talA)和转酮醇酶基因(tktA)，并构建了含有低氧启动子相关基因Pvgb 的木糖加强型表达载体，将其转化到甲酸乙醇基因缺失突变株大肠埃希菌 W3110中。在 W3110 中构建了组成型代谢木糖基因的表达载体，使受体菌获得了利用木糖高效产生 D-乳酸的能力，E.coliW3110突变株中的质粒得到表达，加强重组菌株代谢木糖能力，重组菌株代谢木糖合成 D-乳酸的光学纯度达到 99%以上，产量比出发菌株提高了近 10%。周丽等[14]删除了大肠埃希菌菌株B0013-030 的琥珀酸 (frdA) 和乙酸 (tdcDE)合成途径，并构建了含有突变盒的重组质粒，再将突变盒整合于目的基因上并去除抗性基因，D-乳酸产量达114.5 g/L，光学纯度大于 99.9%。进一步删除了tdcD 和tdcE基因，得到111.9 g/L的D-乳酸产量，乙酸和琥珀酸的合成量降低，其他副产物含量较低。李剑等[15]利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的大肠埃希菌作为宿主，互补筛选获得新型的乳酸脱氢酶基因(ldh)，并通过基因序列分析获得2个保守区域，其中V147～D176区是NADH的结合位点，R77～E107区是酶的活性部位。田甜等[16]以可利用蔗糖的大肠埃希菌HBUT-D1为出发菌株，采用λRed 重组系统技术将大肠埃希菌利用蔗糖的阻遏基因(cscR)敲除，得到1株可降解并促进蔗糖运输的大肠埃希菌工程菌株E.coliHBUT-D2。并对 HBUT-D2 进行厌氧生长驯化，得到1株在厌氧及相同发酵条件下生长良好的菌株HBUT-D。并且进行了发酵条件优化，最终得到了D-乳酸，产量为 62 g/L，光学纯度为99.9%，HBUT-D比出发菌株产酸量提高了38%。

3 乳杆菌

乳杆菌为革兰阳性菌，不产芽胞，多数为益生菌，分解糖的主要产物是乳酸。在自然界中广泛存在。

3.1 乳杆菌的物理、化学诱变育种

Nakano等[17]研究了利用碎米同步发酵产D-乳酸，结果表明乳杆菌发酵过程中，中和剂氢氧化钙可显著提高产酸量。Joshi[18]对乳杆菌(Lactobacilluslactis) NCIM 2368 进行反复的紫外诱变，获得1株能利用纤维素酶水解纤维素材料得到纤维二糖的突变株，乳酸最高产量达到 110 g/L。Demirci 等[19]对D-乳酸产生菌德氏乳杆菌ATCC 9649 进行反复化学诱变EMS诱变，得到生长速率快、滞后期短、乳酸产量高和乳酸耐受性较强的突变株DP3，其最高产酸量达到77 g/L，比原始菌株提高了32.76%。Kadam等对德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii) NCIM 2365 进行驯化和紫外诱变处理，得到1株生长速率较快、滞后期短的诱变突变株 UC-3，在150 g/L蔗糖的条件下，D-乳酸产量最高达135 g/L[16]。

3.2 乳杆菌的基因工程育种

利用分子手段改造乳杆菌是很理想的方法，将乳杆菌的产酸基因转入到其他菌株中，重组菌株便有了两亲本综合的优良性状，得到了研究者所需要的目的菌株，分子手段是改造菌种最有效的方法之一。黄艳燕等[20]将鼠李糖乳杆菌基因组DNA中的D-(+)-乳酸脱氢酶基因ldhD连接到载体pSE380上，将构建的表达质粒转化进入大肠埃希菌，重组菌株经IPTG诱导表达并在大肠埃希菌中检测到D-(+)-乳酸脱氢酶的酶活。

4 其他菌株

其他类型的重组菌株和突变株在D-乳酸的发酵生产中也占有举足轻重的地位，例如粘质沙雷氏菌和酵母菌在基因工程构建D-乳酸高产菌株的研究中，得到了广泛的应用。满永博[21-22]将构建的乳酸脱氢酶质粒pPbud-dldh转入粘质沙雷氏菌，构建得到重组菌株S.MR1-dldh，与出发菌株相比较，葡萄糖的消耗速率加快而且D-乳酸的产量提高到(64.8±1.96) g/L。苏刚等[23-24]对经过基因工程改造的粘质沙雷氏菌R1发酵生产D-乳酸进行了培养基的优化，确定了菌种的培养条件，在含有50 g/L的乳酸盐培养基中筛选对乳酸盐耐受性好的菌株，从而得到乳酸耐受性好的D-乳酸生产菌株，D-乳酸的产量达83.5 g/L。Ishida 等[25]通过敲除酵母菌丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)，再将明串珠菌亚种2个拷贝的D-乳酸脱氢酶基因转入到酵母菌中，该菌株可发酵生产 61.5 g/L 的 D-乳酸，光学纯度达 99.9%以上。Okino等[26]利用基因工程手段构建了产 D-乳酸的谷氨酸棒杆菌。先敲除谷氨酸棒杆菌L-乳酸脱氢酶基因(L-ldh)，再将大肠埃希菌D-乳酸脱氢酶基因转入，该菌株能利用缺氧的矿物盐培养基，发酵生产D-乳酸的量达到120 g/L，光学纯度高于 99.9%。

5 展 望

菌种性能优劣直接关系到发酵工业的成败，一般情况下，野生型菌株往往无法达到工业要求，必须对其进行育种才能实现。传统微生物菌种选育多采用物理或化学诱变剂(紫外线、X 射线、γ 射线、快中子以及各种化学诱变剂)对出发菌株进行诱变，从而获得生产能力提高的突变菌株。随着D-乳酸在工业领域应用范围日益扩大，日益短缺的D-乳酸生产菌种问题逐渐成为限制其工业化的瓶颈。目前，D-乳酸生产菌的改造多采用传统微生物菌种选育方法，部分学者应用基因工程育种方法。然而，微生物是一个复杂的有机体，目的产物的合成需要整个代谢网络的多步酶促反应进行协同作用。仅进行单一酶促反应的基因工程改造对提高菌株的发酵性能作用极其有限。因此，充分利用现有各种D-乳酸产生菌基因组序列信息数据，分别在基因组水平、转录组水平、蛋白质组水平、代谢产物组水平以及代谢通量组水平开展D-乳酸生产菌的代谢网络分析和育种，是D-乳酸生产菌的主要方向。

[1] 丁子建, 柏中中, 孙志浩，等. 芽孢乳杆菌发酵葡萄糖制备D(-)-乳酸的研究[J].生物加工过程, 2004, 2(3): 30-36.

[2] Zhao T, Liu D, Ren H, et al. D-lactic acid production bySporolactobacillusinulinusY2-8 immobilized in fibrous bed bioreactor using corn flour hydrolyzate[J]. Journal of microbiology and biotechnology, 2014, 24(12): 1664-1672.

[3] Nguyen C M, Choi G J, Choi Y H, et al. D-and L-lactic acid production from fresh sweet potato through simultaneous saccharification and fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 81: 40-46.

[4] Zheng H, Gong J, Chen T, et al. Strain improvement ofSporolactobacillusinulinusATCC 15538 for acid tolerance and production of D-lactic acid by genome shuffling[J].Applied microbiology and biotechnology, 2010, 85(5): 1541-1549.

[5] 于培星.高产D-乳酸凝结芽孢杆菌发酵工艺条件的确立[J].中国食品添加剂,2010,99(2): 97-101.

[6] 于培星.高产D-乳酸生产菌株的选育[J].食品与生物技术学报,2010, 29(5):796-800.

[7] 李银镝.D-乳酸高产菌株的选育、发酵条件的优化及代谢通量分析[D].天津：天津大学, 2007.

[8] 刘联杰.产D-乳酸菌株的选育及发酵过程优化[D].武汉：湖北工业大学,2014.

[9] 郑璐,柏中中,许婷婷，等. D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达[J].生物加工过程,2014,12(4):37-42.

[10]胡媛. 共表达型重组大肠杆菌不对称还原生产D-乳酸[D].上海：华东理工大学, 2013.

[11]胡媛, 周文瑜, 魏东芝，等.gdh和ldh基因共表达重组大肠杆菌合成D-乳酸研究[J].药物生物技术, 2014, 21(1): 13-17.

[12]郑辉杰.用基因组重排和进化工程进行菊糖芽孢乳杆菌菌种改进[D].天津：天津大学,2009.

[13]孟武.乳酸生成菌的乳酸发酵调控及分子改造[D].荷泽：山东轻工业学院,2010.

[14]周丽,田康明,左志锐，等.大肠杆菌琥珀酸和乙酸合成途径的删除及其重组菌株的D-乳酸发酵[J]. 生物工程学报, 2011,27(1): 31-40.

[15]李剑, 唐赟, 梁凤来，等. D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达[J].微生物学报,2004,44(4): 491-495.

[16]田甜. 高效利用蔗糖产D-乳酸工程菌的构建及其发酵研究[D].武汉：湖北工业大学,2013.

[17]Nakano S, Ugwu C U, Tokiwa Y. Efficient production of d-(+)-lactic acid from broken rice byLactobacillusdelbrueckiiusing Ca(OH)2as a neutralizing agent[J]. Bioresource Technology, 2012, 104(1): 791-794.

[18]Joshi D S, Singhvi M S, Khire J M, et al. Strain improvement of Lactobacillus lactis for d-lactic acid production[J]. Biotechnol Lett, 2010, 32(4): 517-520.

[19]Demirci A, Pometto A, III. Enhanced production of d(-)-lactic acid by mutants ofLactobacillusdelbrueckiiATCC 9649 [J]. Journal of Industrial Microbiology, 1992, 11(1): 23-28.

[20]黄艳燕,黄靖华,卢福芝，等.鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].生物技术通报,2010, 26(2): 196-200.

[21]满永博.重组粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸[D].上海：华东理工大学, 2013.

[22]满永博,范季瀛,苏刚，等.培养条件及培养基组分对粘质沙雷氏菌生长及产D-乳酸的影响[J]. 化学与生物工程,2013, 30(7): 56-60，70.

[23]苏刚.粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸的研究[D].上海：华东理工大学, 2013.

[24]苏刚,饶犇,沈亚领.粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸的研究[J].工业微生物,2014,44(5):19-22.

[25]Ishida N, Suzuki T, Tokuhiro K, et al. D-lactic acid production by metabolically engineeredSaccharomycescerevisiae[J]. J Biosci Bioeng, 2006, 101(2): 172-177.

[26]Okino S, Suda M, Fujikura K, et al. Production of D-lactic acid byCorynebacteriumglutamicumunder oxygen deprivation [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2008, 78(3): 449-454.

The Research Progress of D-Lactic Acid Fermentation Bacterial Strains

LIU Juan1, WANG Gang1, ZHANG Ming-lei1, JIANG Xing-lin1, GUO Ming-zhu2, CHEN Guang1

(1.Schl.ofLifeSci.,JilinAgric.Uni.,Changchun130118; 2.Coll.ofInformt’n,ChangchunVocat’lInst.ofTechnol.,Changchun130118)

As an important industrial organic acid, D-lactic acid is the intermediate of many chiral substances. It has received increased attention for use as a monomer for the production of biodegradable poly especially. Microbial fermentation is the most important method for D-lactic acid production and microorganisms play a key role in the fermentation method. The research development of D-lactic acid-producing microorganisms was summarized.

d-lactic acid; lactic acid bacteria; lactate dehydrogenase

科技部农业科技成果转化项目(2013GB2B100110)；长春市科技支撑项目(12XN18)；吉林省教育厅项目(2014[465])；

刘娟 女，硕士研究生。研究方向为微生物学。Tel：0431-84532886，E-mail：1040746303@qq.com

* 通讯作者。男，博士，副教授，硕士生导师。研究方向为生物催化与代谢工程。Tel：0431-84532886，E-mail：gangziccc@163.com

2015-02-21；

2015-03-16

Q939.97

A

1005-7021(2016)01-0096-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.016

吉林省秸秆综合利用技术创新平台项目(吉高平台字[2014]C-1)