Rab25基因3′ UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建

周建国，张　钰，吕水萍，王　菲，王　怡，柏玉举，苟晓丽，张廷友，沈　刚，马　虎

(遵义医学院附属医院肿瘤医院暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

Rab25基因3′ UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建

周建国，张钰，吕水萍，王菲，王怡，柏玉举，苟晓丽，张廷友，沈刚，马虎

(遵义医学院附属医院肿瘤医院暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 针对Rab25基因3′端非翻译区(untranslated region，3′UTR)构建Rab25荧光素酶报告基因载体及突变体，为研究miR-125a-5p在肺癌耐药中调控其靶基因RAB25提供有效的工具。方法 PCR扩增包含Rab25的3′UTR的DNA片段，克隆至荧光素酶载体GV306，构建GV306/Rab25′ UTR载体；通过TrgetScan Release 6.2查找Rab25与miR-125a-5p结合区域并设计突变序列，参照构建GV306/Rab25′ UTR载体方法构建GV306/Rab25′ UTR突变载体。结果 通过获得Rab25与miR-125a-5p的种子区域及侧翼部分120~126 nt，并上下延伸150 bp，合成Rab25′ UTR，并且在120~126 nt区域设计突变序列，构建了GV306/Rab25 3′ UTR及其突变载体。结论 成功构建了含Rab25基因3′UTR区的荧光素酶报告基因载体及突变体，为进一步研究Rab25在非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药中的作用打下基础。

[关键词]Rab25；miR-125a-5p；荧光素酶报告基因质粒；非小细胞肺癌；基因调节

miRNAs与多种肿瘤的发生发展有密切关系，其主要通过靶向mRNA的3′非翻译区(3′UTR)降解或抑制mRNA蛋白质翻译，从而影响肿瘤增殖、侵袭及耐药等生物学行为[1-3]。miR-125a-3p和miR-125a-5p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中的表达显著低于周围正常组织[4]。本课题组在前期工作中发现经紫杉醇诱导悬浮培养的A549 CD133+/CD326+亚群细胞中miR-125a-5p的表达异于普通A549细胞[5]。Rab25在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中表达上调，并可促进肿瘤细胞的侵袭和转移[6-7]，也有研究显示Rab25是表皮生长因子受体小分子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)耐药产生的重要分子之一，是参与上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的主要表型之一[8]。关于Rab25与miR-125a-5p二者之间是否有相互作用尚无文献报道，为了研究二者的相互关系及两者联合对肺癌耐药的影响，本研究通过TargetScan Release 6.2预测软件发现，miR-125a-5p与Rab25有相关作用的区域，两者相互作用可能影响肿瘤的生物学行为。为此本研究以荧光素酶报告系统为载体，成功构建了Rab25基因3′UTR荧光素酶报告基因载体及突变体，为后续验证miR-125a-5p与Rab25存在何种相互作用及深入研究miR-125a-5p、Rab25在非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药产生中的作用机制提供前期实验基础。

1材料与方法

1.1材料GeneRuler 1 kb DNA Ladder、DNA marker购自Thermo Scientific 公司，NormalRunTM 250 bp-II DNA Ladder购自GeneRay公司，限制性内切酶购自NEB公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA marker购自Takara公司，Taq Plus DNA聚合酶、ClonExpressTMII一步法克隆试剂盒购自Vazyme公司，GV306载体(图谱见图1)、XbaI / XbaI酶切购自上海吉凯基因公司，琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒购自Biomiga公司，Rab25及其突变体序列由GeneRay公司化学合成，质粒测序由上海吉凯基因公司合成，EndoFree中量质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，E.coliDH5α感受态细胞为肿瘤实验室保存。

图1　GV306质粒的图谱

1.2方法

1.2.1Rab25 3′UTR载体构建从NCBI数据库调取基因3′UTR段的碱基序列，使用TargetScanHuman软件(http://www.targetscan.org/)预测Rab25基因3′UTR段与miR-125a-5p的结合区域，其中第120~126 nt可能为miR-125a-5p作用的种子序列及其侧翼部分序列，上下延伸150 bp，总计合成300 bp左右，由GeneRay公司合成，合成的序列如下：

TCTAGACCACTGGCTTTTTGGTGCCCCTTGTCCCCACTTCAGCCCCAGGACCTTTCCTTGCCCTTTGGTTCCAGATATCAGACTGTTCCCTGTTCACAGCACCCTCAGGGTCTTAAGGTCTTCATGCCCTATCACAAATACCTCTTTTATCTGTCCACCCCTCACAGACTAGGACCCTCAAATAAAGCTGTTTTATATTCTAGA(说明：5'端下划线为XbaI酶切位点，3′端下划线为XbaI酶切位点，其余为编码区)。将Rab25基因3′UTR区合成片段及GV306分别经XbaI/XbaI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切后片段，回收产物在T4 DNA连接酶的作用下于16 ℃链接过夜。将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，于LB中摇床孵育1.5 h，再在含有100 μg/mL 氨苄青霉素(Amp)的固体LB 培养基培养12 h，Amp+固体培养基中筛选培养12 h，挑取8个连接反应菌落，克隆于LB(Amp+)液体培养基培养12 h。按照TIANGEN公司质粒抽提试剂盒说明书抽提质粒，PCR鉴定，PCR鉴定引物如下：Luc-C-F：GAGGAGTTGTGTTTGTGGAC，HSVTK-R：GCGAGGTCCGAAGACTCATTT，验证正确后将重组双荧光素酶报告载体送上海吉凯基因公司测序鉴定。测序鉴定正确的重组载体命名为 GV306/Rab25 3′UTR载体，简称WT-Rab25载体。

1.2.2Rab25 3′UTR突变载体构建根据软件预测结果在RAB25基因3′UTR段的120-126 nt设计出针对miR-125a-5p的突变体，采用化学合成，序列如下：AGACCACTGGCTTTTTGGTGCCCCTTGTCCCCACTTCAGCCCCAGGACCTTTCCTTGCCCTTTGGTTCCAGATATCAGACTGTTCCCTGTTCACAGCACCGGTCCTCTCTTAAGGTCTTCATGCCCTATCACAAATACCTCTTTTATCTGTCCACCCCTCACAGACTAGGACCCTCAAATAAAGCTGTTTTATATTCTAGA，5′端下划线为XbaI酶切位点，3′端下划线为XbaI酶切位点，中间区域为编码区。余法同WT-Rab25载体的构建。将重组双荧光素酶报告突变载体送上海吉凯基因公司测序鉴定。测序鉴定正确的重组载体命名为GV306/Rab25 3′UTR突变载体，简称MUT-Rab25载体。

2结果

2.1Rab25 3′UTR载体构建通过合成RAB25基因3′UTR区域与miR-125a-5p结合的种子区域及侧翼部分120~126 nt，并上下扩增150 bp，共约300 bp，经双酶切后约194 bp，1.5%琼脂电泳分析PCR大小，与预计产物一致(见图2B)。PCR共物和GV306载体经双酶切、纯化、连接转化后挑取4个单克隆菌落培养过夜，质粒提取后PCR鉴定(见图3A)。酶切后送上海吉凯基因测序鉴定，blast比对后与GeneBank公布序列一致(见图4A)。由此我们成功构建了GV306/Rab25 3′UTR载体，简称WT-3′UTR载体。

图2　载体酶切鉴定(A)及Rab25(B)、Mut-Rab25(C)扩增条带

A：GV306/Rab25′ UTR电泳图；B：GV306/Rab25′ UTR突变体电泳图。1：阴性对照(ddH2O)；2：阴性对照(空载自连对照组)；3：阳性对照(GAPDH)；4：Marker自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 Kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5~12: 1~8号转化子。图3　GV306/Rab25′ UTR及其突变体的鉴定

图4　GV306/Rab25′ UTR(A)和GV306/Rab25′ UTR突变体(B)部分测序图

2.2Rab25 3′UTR突变载体构建使用TargetScanHuman软件预测Rab25基因3′UTR段与miR-125a-5p的结合区域，设计出针对miR-125a-5p的突变体(见图5)，由GeneRay公司化学合成该片段。以突变体的基因组DNA为模板进行PCR反应扩增Mut-Rab25 3′UTR，约192 bp，1.5%琼脂电泳分析PCR大小，与预计产物一致(见图2B)。PCR产物和GV306载体经双酶切、纯化、连接转化后挑取8个单克隆菌落培养过夜，质粒提取后PCR鉴定(见图3B)。酶切后送上海吉凯基因测序鉴定，blast比对后与GeneBank公布序列一致(见图4B)。由此我们成功构建了GV306/Rab25 3′UTR载体，简称Mut-3′UTR载体。

图5　RAB25突变载体碱基示意图

3讨论

周璞等[9]的研究显示，Rab25在NSCLC中异常高表达，且与TNM分期、瘤体大小等密切相关。而我们的前期工作亦证实miR-125a-5p在NSCLC耐药细胞株呈低表达[5]，且国内Jiang等[4]的研究证实，miR-125a-5p的下调能够导致NSCLC侵袭转移能力增强，由此推测miR-125a-5p可能预测Rab25存在某种相关性。为了验证两者的相关性，我们采用Targetscan 靶基因预测软件对Rab25 3′-UTR进行分析。发现其存在包括miR-125a-5p、miR-125b、miR-504、miR-499-5p等在内的多个miRNAs互补的种子序列。结合RNA mFold Software对Rab25与miRNAs互补结合位点5'端与3′端各70个核苷酸序列的自由能分析结果，我们认为miR-125a-5p可能是调控Rab25的主要miRNAs。然而，基于软件模型不能完全证实miR-125a-5p与Rab25是否真正具有负性调控的关系，需要通过双荧光素报告系统测定相应荧光的吸光度来验证。既往构建突变体一般是通过突变剂以点突变的形式得以实现[10]，本研究参考国内邵新宏等[11]的方法，直接根据预测软件找到相应的突变序列，参照相应报告基因载体的构建方法，成功构建了对应的突变载体。Rab25基因的荧光素酶报告基因载体及突变体的成功构建将为后续验证Rab25与miR-125a-5p的直接作用关系及二者相关的功能、机制研究提供基础和保障，也将为深入研究二者在肺癌耐药的相关机制奠定基础。

[参考文献]

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[2] Pasquinelli A E. MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an emerging reciprocal relationship. Nat Rev Genet, 2012, 13(4): 271-282.

[3] 郭萌萌, 廖珍媛, 赵娟娟, 等. 自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义. 遵义医学院学报, 2015, 38(3): 219-225.

[4] Jiang L, Huang Q, Zhang S, et al. Hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125a-5p are downregulated in non-small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells. BMC Cancer, 2010, 10: 318.

[5] Lin S, Sun J G, Wu J B, et al. Aberrant microRNAs expression in CD133(+)/CD326(+) human lung adenocarcinoma initiating cells from A549. Mol Cells, 2012, 33(3): 277-283.

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[8] Byers L A, Diao L, Wang J, et al. An epithelial-mesenchymal transition gene signature predicts resistance to EGFR and PI3K inhibitors and identifies Axl as a therapeutic target for overcoming EGFR inhibitor resistance. Clin Cancer Res, 2013, 19(1): 279-290.

[9] 周璞, 刁鑫伟, 汤金梁, 等. Rab25蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义. 解放军医学杂志, 2014, 39(2): 157-160.

[10]周畅, 陈芳, 陆艳霞, 等. PRL-1基因3′UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建. 解剖学研究, 2014, 36(2): 97-100.

[11]邵新宏, 韩渊, 于游, 等. NOTCH1基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定. 中国免疫学杂志, 2013,29(3): 312-316.

[收稿2015-11-06;修回2015-12-18]

(编辑：王静)

Construction of Rab25 gene 3′UTR luciferase reporter vector and mutational vector

ZhouJianguo,ZhangYu,LyuShuiping,WangFei,WangYi,BaiYuju,GouXiao

li,ZhangTingyou,ShenGang,MaHu

(Department of Oncology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University and Guizhou Province Biological Treatment Talent Base, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To construct the dual-luciferase recombinant Rab25 3′-UTR vector and mutational vector. Methods 3′-UTR of Rab25 gene was amplified through PCR method, and was inserted in the dual luciferase reporter vector which was digested by enzyme. The sequence of mutated Rab25 gene was searched in TrgetScan Release 6.2, the mutational vector used the same method. Results we obtained miR-125a-5p with the seed region and the flanking portion of Rab25, and extended vertically 150 bp to synthesize Rab25′ UTR, and used 120~126 nt area to design mutated sequence. Furthermore, 3′-UTR of Rab25 gene and mutated gene were successfully cloned into the GV306 vector, which was verified by gel electrophoresis and DNA sequencing methods. Conclusion The luciferase reporter gene vectors containing Rab25 3′UTR or mutational 3′UTR area were successfully constructed, which will be used for further functional study of EGFR-TKIs resistance in NSCLC.

[Key words]Rab25; miR-125a-5p; luciferase reporter gene plasmid; non-small cell lung cancer; gene regulation

[中图法分类号]R734.2

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0030-05

[通信作者]马虎，男，博士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：胸部肿瘤的基础及临床，E-mail:mahuab@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81360351)；贵州省科技厅攻关项目(NO：黔科字[2013] 3003)；遵义医学院博士启动基金项目(NO：F-577)；贵州省科技厅及遵义医学院、遵义市科技局联合基金重点项目(NO：黔科合J字LKZ[2013]07)；贵州省高层次创新人才“千”层次人才基金项目；遵义医学院研究生社会实践项目(NO：zy-yjs2015004)。