聚醚醚酮表面的亲水改性和胶原蛋白固定化

孙　辉, 于庆松, 杨　彪, 许国志

(1. 北京工商大学材料与机械工程学院, 2. 国家塑料制品质量监督检验中心(北京), 北京 100048)



聚醚醚酮表面的亲水改性和胶原蛋白固定化

孙辉1,2, 于庆松1, 杨彪1, 许国志1,2

(1. 北京工商大学材料与机械工程学院, 2. 国家塑料制品质量监督检验中心(北京), 北京 100048)

摘要采用紫外光接枝法对聚醚醚酮(PEEK)表面进行化学修饰和生物分子固定化. 首先向PEEK表面引入亲水性的丙烯酰胺, 并以此为反应位点通过戊二醛将胶原和胶原蛋白固定在PEEK表面. 用接触角测定仪、 扫描电镜、 荧光标记和X射线光电子能谱等对改性薄膜进行了表征. 结果表明, PEEK上丙烯酰胺的接枝密度高达50.9 μg/cm2; 改性薄膜表面浸润性显著提高, 水接触角最低降至(22±3)°. 荧光标记胶原固定的PEEK薄膜荧光发射光谱强度最高, 并在X射线光电子能谱中检测到N元素, 表明胶原已固定化, 固定胶原蛋白的浓度为10.2 μg/cm2.

关键词聚醚醚酮; 胶原; 表面修饰; 荧光标记

特种工程塑料聚醚醚酮(PEEK)的弹性模量与皮质骨的弹性模量接近, 并且具有优异的力学性能及密度适中、 射线可透过、 化学稳定性好、 可反复消毒和磁共振扫描不产生伪影等优良性能, 已广泛用于外伤、 整形手术、 脊椎及关节外科内植物等医用领域[1,2]. 20世纪80年代末PEEK首先被应用于骨科创伤内固定器械及股骨柄假体, 随后美国AcroMed公司将PEEK应用于椎间融合器[3]. 虽然PEEK在医疗领域有广阔的应用空间, 但其本身的生物惰性和低表面能使其不利于细胞的黏附和生长, 使应用受到限制[2]. 高分子表面修饰和生物分子固定化能够有效改善材料的生物相容性. 我们曾研究了PEEK的表面修饰和生物分子固定化, 通过接枝聚合反应向PEEK表面引入活性官能团[4], 继而实现了肝素[5]、 牛血清白蛋白[6]和壳聚糖的固定化[7]. Ⅰ型胶原是动物体中细胞外基质的主要成分之一, 能够有效促进细胞黏附和增殖[8～10]. 马祖伟等[10]在聚-L-乳酸(PLLA)膜表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA), 并以水溶性的碳二亚胺作为缩合剂, 通过PLLA-g-PMAA表面的羧基和胶原分子中的氨基发生缩合反应, 将Ⅰ型胶原接枝在PLLA表面. 改性后的材料表面更接近组织细胞生长的微环境, 细胞培养结果表明, 改性后的PLLA膜表面软骨细胞的铺展充分, 分布均匀, 且细胞增长速度明显提高.

紫外辐照能有效提高PEEK表面的亲水性, 有助于改善其表面的细胞亲和性[11]. 本文采用紫外光接枝聚丙烯酰胺, 并用戊二醛固定Ⅰ型胶原或胶原蛋白, 用X射线光电子能谱和荧光光谱等表征改性表面. 有望通过简便的光接枝手段, 拓展PPEK的应用领域.

1实验部分

1.1试剂与仪器

PEEK薄膜, 英国ICI Vitrex公司产品, 结构式见Scheme 1 . 丙烯酰胺(AAm)、 戊二醛(质量分数50%水溶液)、 磷酸二氢钾和十二水合磷酸氢二钠, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司; 硫酸亚铁铵、 无水碳酸钠、 碳酸氢钠和丙酮, 分析纯, 北京化工厂; 胶原Ⅰ型(Col), Sigma公司; 胶原蛋白Ⅰ型(HC), 分子量为2000～6000, 上海源叶生物科技有限公司; 十二烷基硫酸钠, 化学纯, 北京益利精细化学品有限公司; 异硫氰酸荧光素FITC, Sigma公司.

紫外灯(高压汞灯), 功率1000 W ; SK2510HP型超声波清洗器, 上海科导超声仪器有限公司; 透析袋, 截留分子量1000; OCA35型视频光学水接触角测量仪, 德国Data physics instruments GmbH; 扫描电子显微镜(SEM), 捷克TESCAN VEGAII公司; UV-2450型紫外可见分光光度计, 日本Shimadzu公司; FluroMax-4NIR型荧光分光光度计, 美国HORIBA Jobin Yvon Inc; ESCALAB 250型X射线光电子能谱仪(XPS), 美国Thermo Fisher Scientific公司.

1.2实验过程

1.2.1胶原蛋白的荧光标记用0.1 mol/L乙酸溶液配制浓度为0.5 mg/mL的胶原分散液, 在室温下磁力搅拌6 h后, 于4 ℃保存备用.

用0.5 mol/L, pH=9.0的碳酸盐缓冲液配制浓度为0.5%的胶原蛋白溶液, 于4 ℃保存备用. 在避光条件下向0.5%的胶原蛋白溶液中加入10 mg异硫氰酸荧光素(FITC), 搅拌后, 于4 ℃反应48 h. 然后用截留分子量为1000的透析袋进行透析, 透析液为0.01 mol/L, pH=7.2的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液). 在4 ℃下, 透析72 h, 每8 h换1次透析液.

1.2.2胶原及胶原蛋白的固定将PEEK薄膜剪成大小为20 mm×30 mm的薄膜, 并依次用丙酮、 乙醇和去离子水经超声波清洗干净, 在室温下晾干. 将预处理后的膜浸泡在10 mg/mL二苯甲酮(BP)的丙酮溶液中10 min, 避光条件下晾干, 得到表面涂敷有二苯甲酮的PEEK 薄膜.

将预处理后的PEEK薄膜或BP处理的薄膜分别浸入0.25, 0.50, 0.75, 1.00 和1.25 mol/L 的丙烯酰胺水溶液[含有阻聚剂硫酸亚铁铵FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O, 与丙烯酰胺质量比为1∶60]中, 在紫外灯下辐照一定时间, 得到PEEK-PAAm膜. 将PEEK-PAAm膜依次用去离子水和乙醇洗涤, 并在阴暗处室温晾干.

用0.1 mol/L, pH=7.4的PBS缓冲液配制质量分数为10%的戊二醛溶液. 在避光条件下, 将PEEK-PAAm膜浸入其中2 h, 得到PEEK-GA膜, 再用大量去离子水冲洗掉表面吸附的戊二醛.

将PEEK-GA膜浸入上述制备好的胶原分散液、 胶原蛋白溶液或胶原蛋白FITC标记液中, 在4 ℃下反应24 h, 形成PEEK-Col, PEEK-HC或PEEK-HC-FITC膜. PEEK-Col膜分别用0.01 mol/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液及去离子水清洗30 min后晾干; PEEK-HC膜用去离子水清洗30 min后晾干; PEEK-HC-PEEK膜用去离子水在避光条件下洗涤30 min后晾干.

1.2.3丙烯酰胺的接枝密度测定参照文献[12]方法, 将接枝薄膜浸入盐酸中, 使PEEK-g-PAAm中—CONH2水解成—COOH和NH2, 水解液用NaOH中和后加入0.12 mol/L的茚三酮, 测定溶液在570 nm处的透光率, 由此得到NH3含量, 再通过与纯PAAm的校准曲线对比, 得到接枝PAAm的含量.

2结果与讨论

2.1PEEK表面的丙烯酰胺接枝聚合和胶原及胶原蛋白固定化

通过紫外光接枝向PEEK表面引入亲水性丙烯酰胺(AAm), 并以此为反应位点进一步键合戊二醛(GA). 胶原或胶原蛋白反应通过与固定剂戊二醛反应实现其在PEEK表面的固定化. 反应过程见Scheme 2.

根据紫外光引发的光接枝反应原理, 芳香酮及其衍生物在紫外辐照下激发到单线态, 由于单线态寿命很短, 迅速窜跃到三线态, 随后三线态夺取基材表面氢原子, 生成羰基游离自由基, 同时在基材表面生成烷基自由基, 引发丙烯基单体丙烯酰胺聚合[13]. 由于PEEK具有类二苯甲酮结构, 在无二苯甲酮光引发剂存在下, UV辐照可以生成半二苯甲酮自由基引发接枝聚合[14～16].

戊二醛是蛋白质在丙烯酰胺接枝材料表面固定的有效偶联剂. 戊二醛与丙烯酰胺接枝聚醚醚酮膜的酰胺基反应生成席夫碱, 将戊二醛连接在PEEK表面; 然后胶原蛋白的氨基继续与戊二醛上醛基反应实现胶原蛋白在PEEK表面的固定[17].

2.2PEEK-PAAm的表面润湿性

采用自引发方式, 在无BP存在下进行紫外光引发表面接枝反应, 阻聚剂硫酸亚铁铵与丙烯酰胺单体质量比为1∶60. 不同丙烯酰胺单体浓度下, PEEK-PAAm膜的水接触角在一定时间范围内均随紫外辐照时间的延长而降低[图1(A)], 达到最低点后, 水接触角几乎不再随紫外辐照时间而变化; 丙烯酰胺单体浓度分别为0.25, 0.50, 0.75, 1.00和1.25 mol/L时, 对应PEEK-PAAm膜的水接触角达到最低值时的辐照时间分别为9, 6, 6, 6和3 min, 且水接触角的最低值均为(22±3)°.

水接触角达到最低值时所需辐照时间随丙烯酰胺单体浓度的提高而缩短; 提高丙烯酰胺单体浓度与延长紫外辐照时间对接触角的影响具有等效性. 中等丙烯酰胺单体浓度(0.50, 0.75和1.00 mol/L)下, 水接触角均在6 min达到最低值. 可见, 在中等浓度时, PEEK-AAm膜的水接触角主要受紫外辐照时间的影响, 而受丙烯酰胺单体浓度的影响较小.

Okada等[11]的研究显示, 简单的紫外辐照引起的PEEK表面官能团的变化等同于等离子体改性: 1和6 h辐照后, PEEK的水接触角分别下降到60.9°和61.4°. 成骨细胞的培养结果表明, 辐照后的PEEK细胞相容性显著改善.

2.3二苯甲酮的影响

选择丙烯酰胺单体浓度为0.5 mol/L, 改变紫外辐照时间, 研究光引发剂二苯甲酮(BP)对丙烯酰胺聚合的影响[图1(B)]. 在无BP存在下, 在辐照时间为6 min时, PEEK-PAAm膜的水接触角达到最低值, 此后, 接触角的角度随辐照时间的延长变化很小; 在BP的存在下, 辐照时间为3 min时, PEEK-PAAm膜的水接触角即达到最低值, 此后, 接触角随辐照时间的进一步延长略有升高, 12 min时达到30°左右. 由于光引发剂BP加快了丙烯酰胺在PEEK上的接枝反应速度, 使其在较短的时间内即可达到接触角的最低值. 同时, BP也使PEEK分子链的稳定性降低, 在紫外辐照条件下加快了PEEK的降解, 使分子链中疏水性基团暴露出来, 所以PEEK-PAAm膜的水接触角在达到最低值后又随紫外辐照时间的延长而有所升高. 在不加BP的情况下, PEEK-PAAm膜水接触角随辐照时间的变化示于图2.

因此, 采用PEEK自引发光接枝, 选择丙烯酰胺单体浓度为0.5 mol/L, 辐照时间为6 min, 硫酸亚铁铵与丙烯酰胺单体质量比为1∶60, 作为最佳实验条件.

在有、 无BP存在下, PEEK上PAAm的接枝密度均随紫外辐照时间的增加而增加(图3). 反应3 min内, 接枝密度增加很快, 并在6 min时达到最大, 分别为50.9和50.2 μg/cm2. 这一变化与接触角的变化规律一致.

2.4表面形貌

PEEK及其改性膜的SEM形貌如图4所示. 未改性PEEK膜表面平整均匀[图4(A)], 而PEEK-PAAm膜表面粗糙, 且有很多纹理[图4(B)], 推测其为丙烯酰胺接枝层.不规则条纹可能由2个因素共同作用: (1)PEEK表面聚丙烯酰胺聚合度不同导致接枝层的厚度不同, 从而形成了不规则条纹; (2)丙烯酰胺在PEEK膜表面不同区域分别形成了不同的接枝层, 各接枝层之间按发生反应的先后顺序会在交界处产生一定程度的重叠, 导致条纹产生; 相比而言, PEEK-GA膜表面比较光滑平整, 条纹表面也变得圆润, 并观测到絮状接枝物[图4(C)]. 膜表面变得光滑平整, 可能是因为小分子戊二醛单层键合到PEEK-AAm膜表面, 覆盖了原来粗糙的表面. 絮状接枝物可能是由于戊二醛与表面聚合度较高的PAAm共价接枝产生, 间接证明了戊二醛的引入; PEEK-Col膜表面观测到大量大小相近的点状接枝物; PEEK-HC膜表面极度粗糙, 并在薄膜表面形成了大量的点状、 条状、 片状薄层, 这些形貌的变化预示着胶原蛋白和胶原的固定化.

2.5改性膜的浸润性

PEEK, PEEK-AAm, PEEK-GA, PEEK-Col和PEEK-HC的接触角分别为83°, 22°, 42°, 33°和20°. 可见, 未改性PEEK亲水性差, 水接触角最高. 可以推断, 酰胺基的亲水性要强于醛基; 胶原蛋白中含有亲水性的氨基、 羧基或羟基等基团, 因而PEEK-Col膜具有较强的亲水性, 且其水接触角低于PEEK及PEEK-GA膜; PEEK-PAAm膜与PEEK-Col膜之间亲水性的差异是由于作为生物大分子的胶原蛋白中的各种氨基酸之间通过氨基与羧基的脱水缩合形成了大量肽腱, 使亲水性基团含量降低, 因而PEEK-PAAm膜表面亲水性基团(氨基)的密度会大于PEEK-Col膜表面亲水性基团(氨基、 羧基或羟基), 所以PEEK-PAAm膜的亲水性强于PEEK-Col膜. 根据水解胶原蛋白分子量的不同, 亲水性的氨基和羧基的含量也有所不同, 分子量越小, 氨基与羧基间脱水缩合的数量则越少, 亲水性基团含量越高, 亲水性越好. 本文采用的水解胶原蛋白分子量为2000～6000, 分子量较小, 亲水性的氨基与羧基含量较高, 因此PEEK-HC膜表面存在大量亲水性的氨基、 羧基或羟基, 而且羧基的亲水性优于氨基, 因此PEEK-HC比其它接枝膜的水接触角都低.

表面浸润性是材料生物相容性的影响因素之一[18,19]. 等离子体表面改性方法已用于提高PEEK表面亲水性[11,20,21]. 研究表明, 紫外辐照后PEEK亲水性的提高有效改善了PEEK表面与鼠成骨细胞的亲和性[11]. 本文结果表明, 光引发丙烯酰胺接枝PEEK的接触角低至22°, 远低于文献报道的简单UV辐照改性PEEK的接触角(～61°), 有效实现了PEEK的亲水改性, 也为生物分子进一步固定化提供了反应位点.

2.6荧光分析

用紫外可见分光光度计检测水解胶原蛋白FITC标记液(HC-FITC)的吸收光谱, 结果示于图5. 可见标记液在480 nm左右达到最大吸收值. 用荧光分光光度计检测PEEK薄膜及其不同接枝膜的荧光发射光谱, 激发波长选择480 nm, 其荧光发射光谱如图6所示.

由于PEEK分子中含有荧光基团苯环, 具有一定的荧光效应[22,23], 所以PEEK空白膜会检测出一定的荧光发射光谱(图6谱线c). 图6谱线a和b分别对应于PEEK-AAm膜和PEEK-GA膜的荧光发射谱, 这2种膜表面由于分别接枝了无荧光效应的PAAm和PAAm-GA, 因此荧光效应较弱, 并且相差无几.

图6谱线d为PEEK-Col膜的荧光发射谱. 组成蛋白质的基本氨基酸有20多种, 而蛋白质中所含的芳香族氨基酸(苯丙氨酸, 色氨酸和酪氨酸残基)在无任何外部因素影响的条件下, 本身具有一定的荧光性[24～26]. 其相对荧光强度比为100∶9∶0.5[27]. 构成胶原蛋白分子的18种氨基酸中没有色氨酸, 而苯丙氨酸在绝大多数条件下不被激发或者吸收强度很低, 很少能观察到苯丙氨酸的发射, 因此胶原蛋白的内源荧光主要来自酪氨酸的贡献[28]. 由于芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸残基)在胶原蛋白分子上只有较低的吸收和荧光量子产率, 所以相比于胶原蛋白或水解胶原蛋白外接荧光探针, 其固有的荧光效应较弱[29]. 图6谱线e为PEEK-HC-FITC膜的荧光发射谱, 由于其表层接枝有荧光探针FITC标记的胶原蛋白, 因此PEEK-HC-FITC膜在所有样品膜中荧光效应最强, 表明了胶原蛋白已固定.

2.7表面元素分析

由未改性的PEEK膜和PEEK-Col膜表面元素的原子百分比[XPS全扫描谱图(图7)]可见, PEEK膜只检测到了O和C元素对应的峰, PEEK-Col图谱上出现了新元素(N)的谱峰, 这是胶原蛋白中的N元素所显现的峰.

由PEEK及PEEK-Col膜的N元素高分辨率XPS谱图(图8)可见, 与未改性的PEEK膜相比, PEEK-Col膜在399.56 eV处可观察到明显的谱峰, 即PEEK-Col薄膜表面N元素的特征峰. PEEK-Col膜上的N元素的原子百分比为9.43%(表1). 由于PEEK本身无N元素, 已固定上胶原蛋白的PEEK-Col膜表面的N元素的含量远远高于空白PEEK膜, 并且2种膜表面C元素和N元素的原子百分比也发生了变化, 从而证明了胶原蛋白已接枝到PEEK薄膜表面.

茚三酮法测得表面固定胶原蛋白的浓度为10.2 μg/cm2., 与马祖伟等[10]用氧化-接枝方法在PLLA固定胶原的浓度相当, 氨基反应密度为8.9%. 由于戊二醛存在不可控自聚, 因此避免戊二醛与氨基的随机反应, 可控实现1个氨基只与同1个或2个戊二醛分子反应, 对于蛋白的固定具有重要影响[13].

3结论

通过紫外辐照下聚醚醚酮的自引发接枝聚合有效实现了聚醚醚酮表面的亲水改性和化学功能化, 接枝密度高达50.9 μg/cm2, 改性聚醚醚酮表面浸润性显著提高, 水接触角降低至23°; 接枝的丙烯酰胺能够作为反应位点实现胶原和胶原蛋白的固定化. 异硫氰酸荧光素标记胶原蛋白改性的聚醚醚酮薄膜显示出最强的荧光效应, 表面固定胶原蛋白浓度为10.2 μg/cm2.

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(Ed.: D, Z)

† Supported by the International Organization for Standardization(ISO) Standards Projects(Nos.19000551742, 19000551406), the National Natural Science Foundation of China(No.31570575) and the Innovative Research Team of Polymeric Functional Film of Beijing Technology and Business University, China(No.19008001071).

Surface Hydrophilic Modification of Poly(ether ether ketone) and Immobilization of Collagen†

SUN Hui1,2*, YU Qingsong1, YANG Biao1, XU Guozhi1,2

(1.CollegeofMaterialsScienceandMechanicalEngineering, 2.ChinaNationalCenterforQualitySupervisionandTestofPlasticProduct,BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

KeywordsPoly(ether ether ketone); Collagen; Surface modification; Fluorescence labeling

AbstractSurface modification of poly(ether ether ketone)(PEEK) was performed to increase the surface wettability. Acrylamide(AAm) was grafted on the surface of PEEK film by ultraviolet grafting to improve the hydrophilicity through the introduction of hydrophilic groups. Then, glutaraldehyde was used to immobilize collagen and hydrolyzed collagen on surface of the material. Fluorescein-labelled collagen was also used to verify the immobilization. The surfaces of PEEK film before and after modification were characterized by contact angle meter, scanning electron microscope, fluorescence spectrophotometer and X-ray photoelectron spectrometer. The results show that the surface morphology and the hydrophilicity are changed significantly after surface modification. Polyacrylamide grated on PEEK has a density of as high as 50.9 μg/cm2. PEEK-g-PAAm becomes hydrophilic with a decreased water contact angle of (22±3)°. Surface immobilized with hydrolyzed collagen labeled with fluorescein isothiocyanate exhibits strong fluorescence effect. Modified films immobilized with collagen showed nitrogen peak, which was not observed for unmodified PEEK film in X-ray photoelectron spectroscopy, indicating the successful immobilization of collagen. The concentration of collagen immobilized on PEEK was determined to be 10.2 μg/cm2.

收稿日期:2016-02-29. 网络出版日期: 2016-05-18.

基金项目:国际标准化组织(ISO)标准项目基金(批准号: 19000551742, 19000551406)、 国家自然科学基金(批准号: 31570575)和北京工商大学高分子功能薄膜创新团队项目(批准号: 19008001071)资助.

中图分类号O631

文献标志码A

联系人简介: 孙辉, 男, 博士, 副教授, 主要从事高分子表面改性及生物质精细化学品的研究. E-mail: cnhsun@yahoo.com