黑曲霉发酵产酶研究进展

张　熙，韩双艳

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)



黑曲霉发酵产酶研究进展

张熙，韩双艳

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

摘要：黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种，它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一，也是重要的酶制剂生产菌种。综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。

关键词：黑曲霉；酶；发酵产酶

黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。

黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。

1黑曲霉产纤维素酶的研究进展

纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。纤维素酶不仅在传统的医药、食品、饲料、饮料、酒类、酱油等行业有应用价值，而且扩展到单细胞发酵、纺织、造纸、环保、能源等新领域。黑曲霉是产纤维素酶产量最高的菌株之一[3]，目前国内外基于黑曲霉发酵产纤维素酶的研究也较为集中。

高星星等[4]为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果，以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质，通过里氏木霉与黑曲霉混合发酵，获得最佳产酶条件。结果发现，滤纸酶活力(FPA)可达1.224IU·mL-1，β-BG可达0.315IU·mL-1。

先天敏等[5]通过单因素实验及均匀设计法实验研究了黑曲霉C112发酵产β-BG的最优条件，所得酶活力最大可达12.925IU·mL-1，较优化前提高了79.0%。

董基等[6]以桔粉为原料，以黑曲霉为发酵菌株，采用液体发酵法生产纤维素酶。结果发现，在添加桔粉80g·L-1、麸皮和蛋白胨质量比为1∶2下培养72h，纤维素酶产量达到1 885.71U·g-1。

Acharya等[7]研究了不同木屑培养环境下黑曲霉产木质纤维素酶的最优条件。结果表明，在碱(2mol·L-1NaOH)预处理木屑浓度9.6%、pH值4.0~4.5、深层发酵转速120r·min-1、发酵温度28 ℃时，纤维素酶活力最大达0.1813IU·mL-1。

黑曲霉发酵产纤维素酶的产量大、活力高、优化程度高、酶功能完整、用途广泛，是一种生产纤维素酶的良好手段。

2黑曲霉产木聚糖酶的研究进展

半纤维素是植物纤维素的主要组成成分，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生生物资源，广泛分布于高等植物的细胞壁中。木聚糖酶通常是内切和外切木聚糖酶的总称，作用于木聚糖主链内部的木糖苷键，将其切断并降解为寡聚木糖和少量单糖。

木聚糖酶的工业化始于1980年左右，最初应用于饲料工业，饲料中添加木聚糖酶系可使植物性饲料更加容易被消化吸收。后来又扩展到食品、纺织和造纸等工业。木聚糖酶作为重要的酶制剂在市场上的份额占总销售额的10%[8]。黑曲霉是发酵产木聚糖酶的菌种之一，目前国内外有很多关于提高黑曲霉产木聚糖酶表达的最新研究。

刘新育等[9]对黑曲霉孢子进行热击处理，探讨了热击处理促进孢子萌发和木聚糖酶活力的机制。结果表明，42 ℃下热击4 h后转入29 ℃发酵，可促使黑曲霉孢子较早萌发和菌丝较快生长。其中，发酵24 h的菌丝干重提高了38.5%，发酵72 h时达到最大生物量，较未处理的提前了12 h。热击处理后的发酵产酶总量和单位质量菌丝产酶量均高于恒温发酵，热击处理对木聚糖酶的种类并没有影响。

Okafor等[10]从废旧木材中分离出一株野生黑曲霉菌株ANL301，研究了其在不同碳源(燕麦木聚糖、木屑、甘蔗浆和小麦糠)下产木聚糖酶的活性。结果表明，发酵96 h后，木聚糖酶活力分别为9.36 U·mg-1、3.37 U·mg-1、5.69 U·mg-1和3.86 U·mg-1。

Betini等[11]将雪白曲霉、黑曲霉和赭曲霉以农业剩余料为底物进行固态发酵产木聚糖酶。其中，黑曲霉在培养基为麦糠和酵母提取物(或蛋白胨)混合物时产酶提高；当以玉米糠和麦糠为混合底物时，黑曲霉的木聚糖酶产量提高了18%，木聚糖酶活力达35 U·g-1。

Dobrev等[12]优化了黑曲霉B03产木聚糖酶的液体发酵条件。研究得到最优培养基为(g·L-1)：(NH4)2HPO42.6，尿素0.9，玉米芯24.0，麦麸14.6，麦芽6.0。优化后的酶活力最高达996.30 U·mL-1，较优化前提高了33%。

黑曲霉发酵产木聚糖酶获得了较高的产量、开发了廉价的农业生产底物，为木聚糖酶的工业化生产提供了良好的基础和条件。

3黑曲霉产蛋白酶的研究进展

蛋白酶是水解肽键的一类酶的总称。按照水解方式的不同，蛋白酶可以分为内肽酶和外肽酶两种。内肽酶主要以蛋白质分子链中间的肽键为作用位点，可以把蛋白质分子切断成为较短的肽链；外肽酶主要从蛋白质分子的末端氨基或羧基进行逐个切割。蛋白酶主要应用在医药、食品、皮革纺织后加工等领域[13]。工业上主要的蛋白酶制剂生产菌株为枯草杆菌、栖土曲霉等。黑曲霉以其食品卫生认可和可观的蛋白酶表达量，也日益成为另一个重要的蛋白酶发酵菌株。国内外的研究主要集中在发酵培养基的组成方面[14]。

方春玉等[15]以泸型大曲中分离的黑曲霉为菌种，采用固态发酵产酸性蛋白酶，酸性蛋白酶活力达24 350 U·g-1，平均酶活比初始培养基提高了64.6%。

罗跃中等[16]对诱变后的黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶的培养基组成及发酵条件进行了优化，得到最适培养基为：米糠20 g·kg-1，碳源玉米粉60 g·kg-1，氮源硝酸铵5 g·kg-1，MnCl24 g·kg-1；最适条件为：料液比1.0∶1.5(g∶mL)，初始pH值7，接种量6 mL·(100 g)-1，40 ℃、180 r·min-1下发酵72 h，摇瓶产酶达到1 120.0 U·mL-1，比基础培养基提高了近2.9倍。

詹深山等[17]以黑曲霉为出发菌株，以提油后的麻疯树饼粕为培养基，采用固态发酵产蛋白酶，控制培养基湿度为50%，添加5%的葡萄糖作为碳源,在此条件下发酵4 d，蛋白酶产量达到最大值9 204 U·g-1。

de Almeida等[18]采用响应面法对黑曲霉ATCC 16404进行产蛋白酶条件优化。研究表明，在底物湿度48%、底物含量 35%、接种量0.18%、反应时间4 d、反应温度30~45 ℃下，酶活力最高达到144.49 U·g-1。

黑曲霉由于本身可分泌大量内源蛋白酶，在利用黑曲酶产蛋白酶方面还有很大的提升潜力，有待进一步研究。

4黑曲霉产淀粉酶的研究进展

淀粉酶是水解淀粉等葡萄糖大分子聚合物的酶类总称，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等。根据产物异构类型的不同，可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶等。其中，微生物分泌表达的淀粉酶一般是指α-淀粉酶。淀粉酶在淀粉加工中发挥重要作用，它可以将微生物难以利用的大分子转化为低聚糖、麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖等小分子，加速生物转化过程。因此，耐酸淀粉酶、耐高温淀粉酶成了目前发酵原料处理方面的研究热点[19]。黑曲霉作为传统的产淀粉酶菌株之一，文献报道较多。

谭海刚等[20]对一株高产蛋白酶和淀粉酶的黑曲霉菌株A020进行研究，确定该菌株的最佳产酶培养基为：香蕉皮基础培养基中添加1%蛋白胨、1%麦芽糖和3×103mol·L-1NaCl，酶活比优化前提高了68.2%。

吴茜茜等[21]研究了固态发酵条件对黑曲霉PZ301合成酸性α-淀粉酶的影响。结果表明，最佳培养条件下酶活力可达19.6 IU·g-1干培养基；菌株的生物量和淀粉酶产量在72 h时均达到最高，这表明耐酸性淀粉酶系同步合成型酶。

Khalaf等[22]研究了黑曲霉菌株O103A产α-淀粉酶的培养基组分。结果表明，以木薯为主要底物的培养基中，酵母提取物2 g·L-1、麦芽糖3 g·L-1对产酶影响最大，优化后的酶活力达到42 U·mL-1。

淀粉酶作为不可替代的工业产品，使黑曲霉等工业微生物产α-淀粉酶的研究成为重要的食品工业议题。

5黑曲霉产脂肪酶的研究进展

脂肪酶是以酯键为催化位点的一类酶，由一个可打开和关闭的“盖子”结构作为催化中心，分为亲水和疏水两种构象，具有多项催化反应(如催化解脂、酯交换、酯合成等)能力，因而成为重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于油脂加工、食品、日化等领域[23]。脂肪酶基因作为外源基因在宿主中表达已成为可靠的技术，在细菌、酵母和丝状真菌都已经实现量产[24]。黑曲霉由于其食品安全性，在食品用脂肪酶的生产上有较多的研究。

陈婧[25]成功将疏棉状嗜热丝孢菌耐热脂肪酶基因(tll)转化到无孢黑曲霉SH-2中，得到的转化子脂肪酶活力为73 U·mL-1；构建糖化酶、淀粉酶以及蛋白酶转录因子的RNAi干扰后，脂肪酶活力提高至97 U·mL-1。转化子进行了2 L发酵罐发酵初步研究，所得脂肪酶活力为187 U·mL-1。

潘力等[26]通过根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标准的黑曲霉转化体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1，成功获得了RML的黑曲霉转化子，并通过优化发酵条件实现了RML的高效表达，对硝基苯酚比色法测得转化子酶活力最高可达15 U·mL-1，是其在酵母中表达水平的10倍以上。

黑曲霉强大的酶表达和修饰体系，使其成为结构复杂的脂肪酶的优良生产菌株。

6结语

黑曲霉不仅在传统酶制剂的发酵生产上具有优势，在其它新酶的生产方面也具有非常广阔的应用前景。黑曲霉在众多微生物表达系统中凸显出优势，主要有以下几个原因：

首先，作为真核生物，黑曲霉细胞内拥有内质网、高尔基体等蛋白后加工模块及复杂的基因排列方式、内含子等原核生物没有的特征，这些特征使黑曲霉表达体系可以生产一些结构较为复杂的蛋白质或酶。许多工业酶、食品酶、医药类酶的结构趋于复杂，是原核生物表达系统(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)无法完善表达的，这使得黑曲霉在结构较复杂的酶种表达领域具有广阔前景。

其次，黑曲霉表达体系不但拥有优秀的蛋白后加工能力，而且秉承了大部分好氧微生物生长快速、代谢旺盛、生存力强的优势，这使得黑曲霉表达体系产出的蛋白和酶质量高、产量大。黑曲霉可适应26~37 ℃的生长温度，耐pH值范围达2.5~6.5，有类似低等植物的生长方式，菌丝发达且分枝多，也有类似酵母菌的孢子生殖方式，分生孢子梗由特化了的厚壁从膨大的菌丝上生出。这样可以确保它在各种环境下快速增殖，并分泌表达各种蛋白质[27]。

另外，黑曲霉基因组中具有众多强启动子。有无强启动子是微生物表达体系能否作为外源蛋白表达工具的重要参考。黑曲霉糖化酶启动子(GlaA)[28]为黑曲霉中运用最广泛的一个诱导型启动子，许多已经工业化的菌株都以它为启动子，并经过基因改造用来生产酶制剂。目前，黑曲霉野生菌株CBS513.88已经完成基因测序，黑曲霉基因的秘密正在被揭开[29]。

与此同时，黑曲霉还具有美国FDA认证的GRAS食品级生产许可，这是许多其它整合表达系统(如毕赤酵母表达系统等)所不具备的，这也为黑曲霉在食品领域的应用提供了质量保障。

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Research Progress on Fermentation Production of Enzyme byAspergillusNiger

ZHANG Xi,HAN Shuang-yan

(SchoolofBioscience&Biotechnology,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Abstract：Aspergillus niger is one of common fungus species.Some characters,such as vigorous growth,short fermentation cycle,no toxins produced during growth,make Aspergillus niger recognized as GRAS(Generally Recognized as Safe) by US Food and Drug Administration(FDA).Aspergillus niger tends to be an important industrial enzyme production strain.In this paper,production of cellulase,xylanase,protease,amylase,lipase by Aspergillus niger is reviewed,and their future prospects of applications are also presented.

Keywords：Aspergillus niger;enzyme;fermentation production of enzyme

中图分类号：Q 939.97

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)01-0013-04

作者简介：张熙(1990-)，男，内蒙古呼和浩特人，硕士研究生，研究方向：微生物发酵及酶催化合成，E-mail：1275926738@qq.com；通讯作者：韩双艳，教授，E-mail：syhan@scut.edu.cn。

收稿日期：2015-09-07

基金项目：广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目(2012A080800013)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.003