急性髓细胞白血病p73基因启动子区域异常甲基化的研究

潘少君　王俊和　李玉云　郝艳梅　胡忠利

蚌埠医学院；①蚌埠医学院第一附属医院血液科　安徽蚌埠　233030



急性髓细胞白血病p73基因启动子区域异常甲基化的研究

潘少君王俊和李玉云郝艳梅胡忠利①

蚌埠医学院；①蚌埠医学院第一附属医院血液科安徽蚌埠233030

[摘要]①目的探讨急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia ，AML)患者p73启动子CpG岛的甲基化状况及其临床意义。②方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测56例AML患者骨髓单个核细胞p73启动子区域甲基化率，同时以30例缺铁性贫血患者作为对照组。χ2检验分析其甲基化程度与临床参数之间的关系。③结果AML组p73甲基化率26%，正常对照组3%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。异常核型急性髓细胞白血病 (karyotypically abnormal AML,KA-AML)组p73甲基化率43%，显著高于正常核型急性髓细胞白血病(cytogenetic normal AML,CN-AML)组(14%)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。AML低危组p73甲基化率为60%、AML中危组为21%、AML高危组为33%，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。④结论AML患者p73甲基化显著高于对照组，提示p73可能参与AML的发生发展；p73在KA-AML中更易发生启动子区域的甲基化；p73甲基化可能不足以成为AML独立的预后指标。

[关键词]p73甲基化急性髓细胞白血病甲基化特异性聚合酶链反应

Study of aberrant p73 promoter methylation in patients with acute myeloid leukemia

PANShaojun,WANGJunhe,LIYuyun,etal

(BengbuMedicalCollege,DepartmentofLaboratoryMedicine,AnhuiBengbu233030,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the methylation status of p73 promoter in patients with acute myeloid Leukemia and explore its significance with clinical data．MethodsMethylation of p73 promoter in bone marrow cells from 56 AML patients and 30 iron deficiency anemia controls were detected by methylation spfecific PCR(MSP)．The changes of p73 methylation status were measured and analyzed with correlated clinical data by chi-square test.ResultsThe prevalence of DNA methylation of p73 gene in AML patients was significantly higher than that in control group (26%vs3%,P<0.05),The prevalence of DNA methylation of p73 in karyotypically abnormal AML (43%) was significantly higher than that in cytogenetic normal AML(14%)(P <0.05) while there was no statistical difference of p73 methylation frequency was seen among the three groups of the low risk group (60%), medium-risk group (21%) and high-risk groups of AML (33%) (P>0.05).Conclusionp73 gene methylation was significantly higher than the control group,suggesting that p73 gene may be involved in the development of AML. p73 promoter region was more susceptible to methylate in the KA-AML than CN-AML.p73 methylation may not be AML independent prognostic indicator.

[KEYWORDS]p73 methylation.Acute myeloid leukemia. Methylation specific polymerase chain reaction

经典抑癌基因p53家族成员p73是由学者Kaghad1977年发现，与p53易突变的特性不同，p73很少突变，又可转录表达具有不同功能的蛋白质异构体。p73在p1启动子作用下，可转录TAp73，诱导细胞凋亡；在p2启动子作用下转录DNp73，抑制细胞凋亡，发挥癌基因作用，在肿瘤的发生、发展、预后等方面具有重要的意义[1]。有研究表明p73在一些血液系统肿瘤中异常甲基化的情况比较常见[2]。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)方法对急性髓细胞白血病(AML)患者进行p73甲基化检测，并探讨其临床意义。

1资料与方法

1.1研究对象初诊AML患者56例，男30例，女26例;正常核型急性髓细胞白血病(CN-AML)35例，异常核型急性髓细胞白血病(KA-AML)21例；低危组5例，中危组39例，高危组12例[根据NCCN预后分组[3]可将AML患者分为3组:预后良好组(低危组)：t(8;21)/AMLl(CBFa)-ETO、inv(16)/t(16;16)/CBFβ-MYH11和t(15;17)/PML-RARa;预后中等组(中危组)：正常核型、tri8、t(9；ll)和其他无明确意义染色体异常;预后不良组(高危组)：复杂核型、-7、7q-、Ilq23/MLL(非t(9;11))、t(9;22)/BCR-ABL]。选择缺铁性贫血患者30例作为对照组，男17例，女13例，标本来源于蚌埠医学院第一附属医院血液科收治患者的骨髓液，中位年龄49岁。56例AML患者均为临床表现、细胞形态学、组织化学染色及免疫、细胞遗传学、分子生物学分型确诊。

1.2实验方法

1.2.1RNA的提取与PCR。用Trizol提取液提取细胞总RNA，溶于20μL DEPC水并鉴定其纯度及完整性，-80℃保存备用，合成cDNA进行PCR扩增。

1.2.2引物。引物分别为p73-MF GGA CGT AGC GAA ATC GGG GTT C p73-MR ACC CCG AAC ATC GAC GTC CG；p73-UF AGG GGA TGT AGT GAA ATT GGG GTT T p73-UR ATC ACA ACC CCA AAC ATC AAC ATC CA；TAp73-F CGG GAC GGA CGC CGA TG TAp73-R GAA GGT CGA AGT AGG TGC TGT CTG G；DNp73-F ACT AGC TGC GGA GCC TCT C DNp73-R TGC TAG CAG ATT GAA CTG G。

1.2.3MSP检测方法。①硫化DNA：提取标本中的DNA，紫外分光光度计测定其纯度及浓度，取500ng DNA按照说明书进行硫化修饰，测定硫化后DNA的纯度及浓度并置-80℃冰箱保存。②MSP：反应体系25μL，硫化DNA 2μL，上、下游引物均为0.5μL,反应条件:95℃ 3min、94℃30s，引物退火温度(TM)60℃ 30s、72℃ 60s，40个循环；72℃ 5min。③凝胶电泳MSP产物分析：MSP产物在琼脂糖凝胶中电泳，结束后在凝胶成像仪上分析并照相。去离子水作为空白对照。

1.2.4判定标准。甲基化(M)判定标准：仅有甲基化引物特异性扩增产物或甲基化和非甲基化引物均有特异性扩增产物；非甲基化(U)判定标准：仅有非甲基化引物特异性扩增产物。

1.3统计学方法率的比较采用χ2检验或Fisher 精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。所有数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。

2结果

2.1AML组和对照组p73基因甲基化率比较56例AML患者的p73甲基化率为26%(15/56)，对照组p73甲基化率低3%(1/30)，见图1。两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

注：U非甲基化引物扩增，M甲基化引物扩增

组别例数(n)阳性阳性率(%)χ2P值AML组5615267.0950.008* M17571.419.3710.000# M217317.62.8550.091 M416318.83.1240.770 M5123252.4940.114 M641252.9930.084对照组3013

注：与对照组比较，*P<0.01;与对照组比较，#P<0.01。

2.2CN-AML与KA-AML患者p73甲基化率的比较CN-AML患者的p73甲基化率为14%(5/35)，KA-AML患者p73甲基化率43%(9/21)，2组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　两组AML患者p73基因甲基化率比较

注：与KA-AML组比较，*P<0.05

2.3AML患者低危组、中危组和高危组3组间p73甲基化率比较低危组AML患者p73甲基化率为60%(3/5)，中危组为21%(8/39)，高危组为33%(4/12)，3组比较差异无统计学意义(P=0.145>0.05)，见表3。

表3　3组AML患者p73基因甲基化率的比较

注：3组之间比较，*P>0.05

2.4p73甲基化的AML患者TAp73与DNp73表达情况p73甲基化AML患者TAp73阳性率20%(3/15),对照组TAp73阳性率90%(27/30)，两者比较差异有统计学意义(图2，表2)；p73甲基化AML患者DNp73阳性率100%(15/15)，对照组DNp73阳性率83.3%(25/30)，二者比较差异无统计学意义，见图2，表2。

图2　RT-PCR检测TAp73、DNp73表达

组 别nTAp73-+DNp73-+p73甲基化AML组15123015对照组30327525

注：p73甲基化AML组和对照组TAp73阳性率比较，χ2=22.05,P<0.05;p73甲基化AML组和对照组DNp73阳性率比较，χ2=2.813,P>0.05。

3讨论

AML是一种由原始造血干细胞增殖失控,反复细胞遗传学异常的异质性疾病，大部分AML患者具有正常核型，然而在这些患者中，通常很难预测长期预后[4]。CN-AML患者新型分子标记物,包括FLT3mt或NPM1ITD以及抑癌基因甲基化已有报道跟预后有关[5]。 前者已得到广泛临床实践，后者尚未证明是有用的预后指标，由于有些白血病缺乏染色体(基因)的改变，表观遗传变化甲基化可能是导致疾病发生的主要因素，于是经典抑癌基因家族成员p73甲基化的研究成了研究热点。目前已有大量资料研究表明在急性淋巴细胞白血病中，p73甲基化使其自身表达缺失，从而参与肿瘤的发生发展，而p73在AML的甲基化状态及是否与疾病预后相关国内外尚未见报道。本研究采用MSP方法检测AML中p73的甲基化情况，结果显示：AML患者的p73甲基化率为26%，明显高于对照组(3%)，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，这提示p73甲基化可能参与了AML发生发展。AML的亚组中除了M1组与对照组间差异有统计学意义,其他各亚组与对照组比较差异无统计学意义，但需要说明的是亚组例数偏少，需要扩充病例进一步研究。我们还将p73甲基化的15例AML患者标本进行TAp73和DNp73检测，结果显示DNp73均表达，且其中12例患者出现TAp73的缺失，这提示p73甲基化可能和TAp73缺失有关，TAp73可能有抑制AML发生的作用。p73甲基化可能使促凋亡功能的TAp73表达缺失，而起着抑制凋亡作用的DNp73可能促进了AML的发展，这一点在其他学者的研究中也得到验证。Hofstetter G[6]等认为p73通过不同启动子转录，可产生TAp73和DNp73两种不同的亚型，这两种亚型在人类肿瘤细胞和肿瘤细胞株均有表达，TAp73与p53由于结构方面的相似性，在抑癌、促细胞凋亡等方面具有相似功能；而DNp73结构与p53有较大差异，表现出与p53不尽相同的功能，通过阻断TAp73与p53的转录活性，对其诱导细胞凋亡产生负调控，具有抗细胞凋亡和致癌作用。同时Conforti等[7]研究发现DNp73是肿瘤中p73表达的主要形式，在肿瘤中的表达明显增高，根据目前已知的DNp73具有抗细胞凋亡和致癌作用，考虑肾母细胞瘤中p73的表达亚型可能以DNp73为主。Daskalos等[8]利用MSP及实时荧光定量PCR方法对102例非小细胞型肺癌检测p73基因p1、p2启动子的甲基化状态及p73亚型(TAp73、DNp73)mRNA的表达水平，结果发现：p1启动子的高甲基化抑制了TAp73 mRNA的表达水平；p2启动子的低甲基化与DNp73 mRNA的过表达密切相关，进一步证实抑癌基因(TAp73)高甲基化可导致基因沉默，癌基因(DNp73)低甲基化可致基因激活。Corn[9]等认为p73基因有复杂剪切变体(包括TAp73和DNp73)。长剪切变体起源于5'启动子，即TAp73是CpG岛内启动子转录，此启动子的甲基化导致促凋亡TAp73基因沉默，同时可能允许保留抗凋亡基因DNp73的表达。而我们的实验还将AML按照核型异常与否将AML分成两组：KA-AML组和CN-AML组，然后将两组患者的p73甲基化率进行比较，我们发现p73在KA-AML有更高的甲基化率(43%)。异常染色体核型通常和复杂细胞遗传学有关而不仅仅是单个染色体的变化，还有表观遗传学异常等，KA-AML染色体变化的影响可能超过CN-AML表观遗传学基因沉默的生物学影响。Niemantsverdriet等[10]证实p73的高表达与患者较差的生存率密切相关，而我们将AML患者按照NCCN预后分组分成3个危险组，即低危组、中危组和高危组，检测3组p73甲基化率，进行统计分析发现3组间差异无统计学意义，提示p73甲基化不足以成为AML患者的独立预后指标，需进一步研究。

总之，我们的研究表明p73甲基化在AML患者中较为常见，与疾病的发生发展可能相关，且与核型异常有关，为了给AML的特异性诊疗提供新的思路，有必要加大样本进一步研究p73甲基化。

参考文献

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[3]NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines TM).Acute Myeloid leukemia-Version 2.2011

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[6]Hofstetter G，Berger A，Chamson M,et al．Clinical relevance of TAp73 and DNp73 protein expression in ovarian cancer：a series of 83 cases and review of the literature[J]．Int J Gyneeol Pathol，2011,30(6)：527-531

[7]Conforti F，Yang AL，Agostini M，et al．Relative expression of TAp73and DNp73 isoforms[J].Aging(Albany NY),2012,4(3):202-205

[8]Daskalos A,Logotheti S, Markopoulou S,et al.Global DNA hypomethylotion-induced DNp73 transcriptional activation in non-small cell lung cancer[J].CancerLett,2011,300(1):79-86

[9]Corn PG,Kuerbitz SJ,Van Noesel MM,et al.Transcriptional silencing of the p73 gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkitt's lymphoma is associated with 5'CpG island methylation[J].Cancer Res,1999,59(14):3352-3356

[10]Niemantsverdrilet M，Nagle P，Chiu RK，et a1.DNp73 enhances promoter activity of TGF-β induced genes[J].PLOS One,2012,7(12):e50815

(张爱国编辑)

读者·作者·编者

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【通讯作者】李玉云。

【作者简介】潘少君(1984-)，女，硕士，助教。研究方向：白血病、抑癌基因。

【基金项目】安徽省蚌埠医学院自然科学研究项目(编号：BYKY1440)；安徽省高等学校省级自然科学研究项目(编号：Kj2012A198)。

[中图分类号]R 551

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)01-008-4