小鼠皮下及肺转移肿瘤模型制备

宋天姣　曹倩文　王　娜　田　雨　郑全辉

华北理工大学　河北唐山　063000；①河北省慢性疾病重点实验室



小鼠皮下及肺转移肿瘤模型制备

宋天姣曹倩文王娜田雨郑全辉①

华北理工大学河北唐山063000；①河北省慢性疾病重点实验室

[摘要]①目的经皮下和尾静脉注射，制备小鼠黑色素瘤细胞增殖、转移模型。②方法体外培养黑色素瘤细胞，分别经腋部皮下和尾静脉注射接种C57BL/6小鼠，接种剂量分别为1×106/只和3×105/只，2周后观察黑色素瘤形成及肺部转移情况。③结果黑色素瘤细胞注射2周后，经皮下接种的小鼠腋窝出现明显肿瘤，成瘤率达100%;经尾静脉注射的小鼠肺部出现大量黑色素瘤结节， 肿瘤转移率达90%。④结论经皮下和尾静脉注射方法能够成功制备小鼠的肿瘤细胞增殖和转移模型。

[关键词]肿瘤细胞黑色素瘤增殖转移

Preparation of subcutaneous and pulmonary metastasis mouse models

SONGTianjiao,CAOQianwen,WANGNa,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.MethodsMelanoma cells(1×106/100uL)were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3×105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metastasis mouse model.Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melanoma cell injection.ResultsThe subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100%.The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98%.ConclusionTumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully prepared by subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.

[KEYWORDS]Tumor cell metastasis.Melanoma.Proliferation.Transfer

目前恶性肿瘤已成为一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制仍未完全阐明，对肿瘤有效的治疗措施还处在不断探索之中。小鼠肿瘤模型在揭示肿瘤发病原因，探索发病机制以及评估治疗措施中有着不可替代的作用[1]。本研究以体外培养的黑色素瘤B16细胞作为瘤种，采用皮下和尾静脉注射方法建立肿瘤细胞增殖和转移模型，以期为后续肿瘤免疫学发病机制和治疗研究提供实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株。小鼠B16黑色素瘤细胞由中国医学科学院药物研究所惠赠，在含10%胎牛血清及双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的RPMI 1640(GIBCO公司)培养液中培养，条件是饱和湿度、37℃、5%CO，2～3d更换1次培养液，细胞达到95% 融合时用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化、传代培养。

1.1.2动物。C57BL/6 小鼠由中国食品药品检定研究院提供[许可证号：SCXK(京)2009-0017],SPF级环境培养。

1.2方法

1.2.1小鼠皮下黑色素瘤模型制备。消化、收集B16黑色素瘤，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤2次，将细胞悬浮于生理盐水中，台盼蓝染色细胞活力大于95%，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×107/mL,对小鼠进行皮下接种。①分组：取6～8周龄，雌性C57BL/6小鼠20只，随机分成实验和对照组，每组10只；②接种：对小鼠腋下皮肤进行酒精消毒，实验组小鼠注射B16细胞100μL/只(1×106)，对照组小鼠注射等量生理盐水，2周后解剖小鼠观察肿瘤生长情况。

1.2.2小鼠肺转移黑色素瘤模型的制备。收集B16黑色素瘤细胞，用无菌生理盐水调整细胞浓度为3×106/mL。选取6～8周龄，雌性C57BL/6小鼠20只，分组同上。小鼠首先用红外灯照射3～5min，待尾静脉清晰可见后酒精消毒。实验组小鼠注射黑色素瘤细胞100μL(3×105)/只，对照组小鼠注射等量生理盐水。2周后解剖小鼠观察肺黑色素瘤转移。

2结果

2.1B16黑色素瘤细胞培养常规培养B16黑色素瘤细胞，当其密度达到细胞瓶的95%时传代、扩增培养，直至细胞数量达到接种要求,见图1。

图1　B16黑色素瘤细胞培养。放大倍数：40×

2.2皮下黑色素瘤小鼠制备实验组小鼠在皮下接种B16细胞7d后腋下开始出现可触及的肿瘤，成瘤率达100% (10/10);2周后肿瘤明显增大，几乎累及整个小鼠的腋窝。解剖小鼠后可见明显肿瘤团块形成，见图2。

图2　小鼠皮下黑色素瘤模型制备

2.3黑色素瘤肺转移小鼠制备B16细胞尾静脉注射2周后处死小鼠，取肺组织观察。实验组小鼠发生黑色素瘤细胞肺转移率达90%(9/10)。由图3可以看出，对照组小鼠肺脏成粉红色，表面光滑；实验组小鼠肺脏苍白，各个肺叶都长有大量黑色素瘤结节。

图3　小鼠肺转移黑色素瘤模型制备

3讨论

肿瘤动物模型在研究人类肿瘤发生、发展机制，体内观察各种肿瘤治疗效果以及探索新的肿瘤治疗途径方面发挥重要作用。在各类动物中，由于小鼠具有明确、稳定的遗传性状，对肿瘤易感以及成本较低的优点，因而广泛应用于肿瘤的基础和临床研究。小鼠肿瘤模型按照建立方法可分为多种类型，如：基因修饰小鼠肿瘤模型，自发和诱发小鼠肿瘤模型以及移植小鼠肿瘤模型[2]。后者将移植抗原性与宿主相同的肿瘤细胞系接种于小鼠体内，由于不存在或仅有很低的移植排斥反应，因而肿瘤细胞能够稳定生长且生物性状很少发生改变，故成为国内外常用的肿瘤动物模型制备方法之一。

B16黑色素瘤细胞是来源于C57BL/6小鼠的自发性肿瘤细胞，同时也是为数不多产生色素的肿瘤细胞系之一[3]。B16细胞具备大多数肿瘤细胞的共同特点如生长迅速，MHCⅠ类分子表达低易逃避机体免疫监视，侵袭性强易发生转移等[4]。在本次实验中我们观察到皮下注射B16细胞小鼠肿瘤形成快，成瘤率高，且成瘤率受细胞注射剂量的影响小。可为后续肿瘤干预处理或肿瘤发展机理研究提供便利条件。

尾部静脉注射是制备肿瘤转移模型的常用方法, 我们预实验中尝试不同剂量的B16细胞如1×105/只、3×105/只和1×106/只注射, 发现1×105/只剂量组肺转移率低，约50%，可能与细胞数量少有关。而采用1×106/只注射，发现有些小鼠在注射完之后，出现痉挛，活动下降，随后死亡，估计是形成癌栓，造成了肺栓塞的缘故[5]。因此，我们采用3×105/只注射，发现B16细胞的肺转移率能够达到90%，且肺部的黑色素瘤结节比较清晰，肉眼即可计数肿瘤转移灶数目，对肿瘤转移干预处理的后续研究提供了便利、可行的实验材料。

在此实验中，我们通过黑色素瘤B16细胞的皮下注射和尾静脉注射建立了肿瘤细胞体内增殖和转移的小鼠模型，且两种肿瘤模型的制备操作简便，成瘤率和转移率高，实验周期短，为后续研究肿瘤发生、发展、转移机制以及探索肿瘤治疗新途径提供了实验基础。

参考文献

[1]张峻岭,陈子逸,陈国卫,等. 新的临床前研究小鼠模型：肿瘤患者来源的移植瘤[J].肿瘤,2014,34(3):291-294

[2]Qiu W,Gloria H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev, 2013,32(0):1007-1012

[3]Scott A, Elizabeth W, Abigail L，et al. Local expression of interleukin‐2 by B16 melanoma cells results in decreased tumour growth and long‐term tumour dormancy[J]. Immunology, 2013, 138(3): 280-292

[4]Nayoung L, Steven R, Tobias S. Melanoma stem cells and metastasis: mimicking hematopoietic cell trafficking?[J]. Lab Invest,2014, 94(1): 13-30

[5]陈愉生，林小芬，李鸿茹，等.肺癌转移瘤动物模型的建立[J]. 中国实验动物学报,2014,22(5): 32-34

(张爱国编辑)

【通讯作者】郑全辉。

【作者简介】宋天姣(1994-)，女，本科生。研究方向：肿瘤免疫。

【基金项目】国家自然科学基金项目(编号：8137311)；河北省自然科学基金项目(编号：p013209019)；华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(编号：X2015153)。

[中图分类号]Q 784

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)01-001-2