促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对AKT蛋白表达的影响

许卫，陈永权，伍金雷，刘欣，陈晞明△，陈盛强，孙卫文



促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对AKT蛋白表达的影响

许卫1，陈永权1，伍金雷1，刘欣1，陈晞明1△，陈盛强2，孙卫文2

摘要：目的观察促红细胞生成素（EPO）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对蛋白激酶B （AKT）蛋白表达的影响。方法30只成年雄性SD大鼠先按随机数字表法分为2组，假手术（Sham）组（n=6）和模型（Model）组（n=24）；模型组采用腹主动脉缩窄术建立CHF模型，术后8周存活16只，再随机分为EPO组与对照（Control）组各8只。EPO组予以3 000 U/kg EPO腹腔注射，3次/周，连续4周；Sham组、Control组给予等量的生理盐水。分别在术后4周、8周、12周（即给药4周）行心脏彩超检查大鼠心功能。第12周末全部大鼠禁食24h后处死，观察心肌组织细胞形态、心肌细胞凋亡及计算凋亡指数（AI）；采用Western blot法检测心肌P-AKT/AKT蛋白表达情况。结果超声心动图显示Model组4周时出现心室肥厚，8周时出现心力衰竭；EPO干预4周后较Control组左室射血分数（LVEF）明显升高（P < 0.05），收缩末期室间隔厚度（IVSs）、收缩末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd）明显降低（P < 0.05）。EPO组AI较Control组显著降低（23.87%±1.45% vs 35.58%±2.81%，P < 0.01）；与Sham组（0.81±0.17）比较，Control组（0.35±0.06）P-AKT/AKT OD值明显降低，EPO组（1.61±0.16）较Control组升高（P < 0.01）。结论EPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌细胞凋亡，促进AKT的磷酸化。

关键词：红细胞生成素；心力衰竭；心肌凋亡；AKT蛋白

慢性心力衰竭（chronicheart failure，CHF）是多种心血管疾病的最终归宿，严重影响着患者的生活质量和健康水平，给家庭带来了沉重的经济负担[1]。新近有研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对大鼠急性心肌梗死、急性心力衰竭具有保护作用[2-3]。目前有关EPO对CHF的治疗作用尚少见报道。本研究拟建立大鼠CHF模型，并予以EPO干预，通过观察超声心动图、心肌细胞凋亡率以及蛋白激酶B（AKT）磷酸化的表达，探讨EPO是否具有抗CHF心肌凋亡作用及其可能的机制，旨在为CHF的治疗提供新的思路。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物8～12周龄SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（241.40±16.70）g，购自南方医科大学实验动物中心。所有大鼠均在相同的条件下饲养，自由取食和饮水。饲料由南方医科大学实验中心提供。

1.1.2药品及试剂EPO（10 000 U/mL）购自沈阳三生制药公司，TUNEL试剂盒购自Sigma公司，AKT与P-AKT抗体均购自Cell Signaling Technology（USA），GAPDH抗体购自ProteinTech Group，Inc（USA）。

1.2方法

1.2.1分组及模型建立采用随机数字表法，先将30只大鼠分为模型（Model）组（n=24）与假手术（Sham）组（n=6）。模型组采用腹主动脉缩窄法建立CHF模型。术前1 d禁食水，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉，打开腹腔、暴露左肾静脉，距左肾静脉上方10～15mm处钝性分离腹主动脉，用4-0丝线穿过分离的腹主动脉，在腹主动脉旁置7号针（直径0.7mm），与腹主动脉平行，结扎后抽出针，拔针时以有箍筋感为宜，使腹主动脉缩窄达60%～70%，关闭腹腔。术后常规腹腔注射阿米卡星（0.2mL/d）抗感染3 d，饲养观察8周，制成CHF模型。Sham组：在腹主动脉相同部位穿线但不结扎，余同模型组。

1.2.2模型建立后分组和干预术后8周末Model组存活16只，将存活的16只Model组大鼠再次按随机数字表法分为2组：EPO组（n=8）；将10 000 U/mL EPO用生理盐水稀释成1 000 U/mL，按3 000 U/kg EPO腹腔注射，3次/周，连续4 周[4]。Control组（n=8）予等量生理盐水腹腔注射，3次/周，连续4周。Sham组处理同Control组。12周末时，Control组死亡2只，Sham组与EPO组无死亡。

1.2.3心脏彩超检查分别在术后4周、8周、12周（即给予EPO 4周）后行心脏彩超检查大鼠心功能。禁食24h后，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉、备皮，应用超声心动仪（ie33型号，PHILIPS公司）及7.5mHz高频线控探头（PHILIPS公司）进行超声检测。检测左室射血分数（LVEF）、收缩末期室间隔厚度（IVSs）、收缩末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd）。

1.2.4心内采血和心肌组织标本处理于第12周末全部大鼠禁食24h行心脏彩超检查后，10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉，开胸，心内穿刺采血，剪取全部大鼠心尖部约5mm×5mm×5mm心肌组织，放入预冷的PBS溶液中冲洗至溶液无红色，置于液氮中速冻后存于-80℃超低温冰箱，待分子生物学实验用；剩余部分心脏组织经预冷的生理盐水溶液灌注3min，再经4%多聚甲醛溶液灌注固定20～30min后取心脏，立即置于4%多聚甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，制成3～4 μm厚石蜡切片，待用。

1.2.5病理检查从上述已制成的石蜡切片中，各组随机取3张切片，采用苏木精-伊红（HE）染色，200倍光镜下观察，镜下观察各组心肌组织形态结构及炎症细胞浸润情况。

1.2.6TUNEL原位末端标记法检测细胞凋亡从已制成的石蜡切片中，各组随机取3张切片，按照TUNEL试剂盒操作方法检测心肌细胞凋亡，荧光显微镜下观察凋亡细胞荧光显色并采取图像，再进行DAB显色，每张切片在高倍镜（×400）下随机读取6个不重叠视野，以细胞核中有染成棕色为阳性细胞。计数后，计算细胞凋亡指数（AI）=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数×100%，取其平均值进行统计分析。

1.2.7Western blot法测定P-AKT/AKT蛋白表达心肌组织经研磨、裂解后用酶标仪测蛋白浓度，根据所测得蛋白浓度上样总蛋白质量为80 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用电印迹转移法将蛋自质转至PVDF膜，丽春红S染色，根据所需目标条带剪膜，用质量浓度为5%的脱脂奶粉的TBS-T溶液室温封闭2h后，分别加入兔抗AKT、P-AKT单克隆抗体和GAPDH抗体，4℃孵育过夜，室温下TBS-T溶液洗膜后加入兔（鼠）二抗孵育2h，用TBS-T溶液洗膜后与ECL试剂反应，胶片曝光，扫描胶片，用Image J软件计算条带光密度（OD）值，以AKT、P-AKT与GAPDH条带的OD比值来评定的AKT、P-AKT蛋自质的表达水平。

1.3统计学方法应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t检验；多组均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1建模、EPO干预前后超声心动图指标的变化见表1。造模4周后，Sham与Model组大鼠LVEF差异无统计学意义（P>0.05）；Model组LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd显著升高（P < 0.05），表明Model组大鼠发生心肌肥厚。造模8周后，Model组大鼠LVEF显著下将（P < 0.01），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham组（P < 0.05），表明Model组大鼠CHF模型建立成功。建模12周（EPO组给药4周），与Sham组比较，Control组大鼠LVEF进一步下降（P < 0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd进一步增高（P < 0.05），表明Control组大鼠心力衰竭进一步加重；与Control组比较，EPO组大鼠LVEF明显增加（P < 0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明显降低（P < 0.05），表明EPO能够改善CHF大鼠的心功能，逆转心室肥厚。

Tab.1　Comparison of echocardiography 4, 8 and 12 weeks of operation 表1建模后4、8、12周超声心动图比较　（±s）

Tab.1　Comparison of echocardiography 4, 8 and 12 weeks of operation 表1建模后4、8、12周超声心动图比较　（±s）

＊P < 0.05，＊＊P < 0.01；a与Sham组比较，b与Control组比较，P＜0.05；表2同

周数组别Sham组Model组t Sham组Model组t Sham组Control组EPO组t 4 4　8 8　1 2 n6 1 6　6 1 12 12 6　6 6 8 LVPWs（cm）0.276±0.005 0.355±0.015 5.467＊＊0.297±0.020 0.381±0.021 5.237＊＊0.310±0.039 0.439±0.009a0.354±0.008b10.177＊＊IVSs（cm）0.278±0.007 0.327±0.060 2.420＊0.311±0.008 0.364±0.022 3.265＊＊0.334±0.017 0.392±0.010a0.375±0.019b5.755＊LVPWd（cm）0.171±0.008 0.264±0.012 3.136＊0.192±0.009 0.294±0.025 3.148＊＊0.206±0.013 0.307±0.011a0.243±0.014b13.584＊＊IVSd（cm）0.167±0.004 0.228±0.013 2.283＊0.187±0.008 0.242±0.020 2.515＊0.199±0.011 0.271±0.008a0.215±0.015b7.322＊＊LVEF 0.884 8±0.183 2 0.826 0±0.130 5 1.409 0.865 7±0.145 3 0.655 7±0.167 2 8.426＊＊0.823 5±0.137 8 0.606 3±0.272 1a0.716 6±0.348 2ab32.308＊＊

2.2HE染色结果Sham组新生鼠心肌细胞排列整齐而紧密，染色清晰，结构完整，细胞核致密、清晰可见，呈椭圆形或长杆形，显蓝色，见图1A。Control组心肌细胞排列紊乱，细胞核不规则，呈浓缩状，心肌间质水肿明显，部分心肌发生纤维化，有炎性细胞浸润、聚集，见图1B。EPO组心肌细胞排列紊乱、间质水肿及炎性细胞浸润、聚集均较Control组减轻，见图1C。

2.3心肌细胞凋亡的变化Sham组细胞核清晰可见，核较大，边界清楚，染为蓝色，见图2A。Control组可见大量棕色深染的固缩、聚集的呈棒状的细胞核（箭头所示），为发生凋亡的细胞核，见图2B。EPO组深染的棕色细胞核较Control组明显减少，见图2C。与Sham组比较，Control组AI显著增加；与Control组比较，EPO组AI有所降低，但仍高于Sham组（P < 0.01），见表2。

Tab.2　Comparison of the expression of P-AKT /AKT protein (OD) andmyocardial apoptosis index (AI) between three groups表2　各组P-AKT/AKT蛋白相对表达量（OD）及心肌细胞凋亡指数（AI）比较　（±s）

Tab.2　Comparison of the expression of P-AKT /AKT protein (OD) andmyocardial apoptosis index (AI) between three groups表2　各组P-AKT/AKT蛋白相对表达量（OD）及心肌细胞凋亡指数（AI）比较　（±s）

组别Sham组Control组EPO组F n6 6 8 P-AKT/GAPDH 0.473±0.101 0.248±0.056a0.866±0.078ab16.864＊＊AKT/GAPDH 0.644±0.048 0.654±0.037 0.612±0.062 0.309 P-AKT/AKT 0.810±0.173 0.351±0.067a1.623±0.156ab24.437＊＊AI（%）8.03±0.89 35.58±2.81a23.87±1.45ab53.128＊＊

2.4Western blot法检测心肌P-AKT/AKT蛋白表达各组AKT/GAPDH的OD值差异无统计学意义（P > 0.05）。与Sham组比较，Control组P-AKT/GAPDH及P-AKT/AKT OD值均明显降低；与Con⁃ trol组比较，EPO组P-AKT/GAPDH及P-AKT/AKT OD值均显著升高，且高于Sham组（P < 0.05），见表2、图3。

Fig.3　The expression of P-AKT /AKT protein inmyocardial samples twelve weeks after operation detected by Western blot assay图3　Western blot检测建模12周后心肌P-AKT/AKT蛋白的表达情况

3　讨论

3.1EPO在心力衰竭中的作用CHF的病理生理改变十分复杂。研究发现，细胞凋亡在CHF中起了重要作用[5]。心肌细胞凋亡可引起心肌细胞数量减少，进而引起心肌收缩功能的下降，当心肌细胞减少到一定程度必然引起CHF的进行性恶化，最终导致心室壁变薄、心腔扩大，严重影响患者的预后。心肌细胞凋亡与炎性细胞因子、交感神经活性增加、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）激活等多因素的作用最终导致CHF。EPO是一种造血生长因子，新近研究发现EPO还具有抗炎、抗凋亡、促进新生血管生成等多种作用来发挥组织保护作用[6]。然而，EPO是否具有抗凋亡作用改善CHF的心功能、逆转心室肥厚的作用的研究国内外少见报道。本课题组前期研究采用腹主动脉缩窄术建立CHF模型，腹主动脉缩窄术是建立压力超负荷心力衰竭模型常用的方法，在腹主动脉缩窄术术后6周大鼠便出现失代偿性心力衰竭[7]。本研究在造模后8周（EPO干预前）Model组大鼠心脏肥厚、心功能降低，这与以往的研究相同[7]，表明心力衰竭模型成功建立。实验结束时（EPO干预后），EPO组较Control组心功能参数上LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd及LVEF明显改善,说明EPO能明显改善心力衰竭大鼠心功能，逆转心室肥厚。本研究结果显示，与Sham组相比，Control组心功能显著恶化，细胞AI显著升高，P-AKT/AKT显著降低；EPO干预后，EPO组心功能较Control组显著改善，细胞AI较Control组显著减轻，P-AKT/AKT显著升高。该结果不仅证实心肌细胞凋亡是CHF的发生、发展及恶化的重要环节，同时还表明EPO干预可有效改善CHF大鼠的心功能，该作用可能与抑制心肌细胞凋亡及增加AKT的磷酸化有关。

3.2P-AKT/AKT在EPO治疗CHF中的影响给予EPO干预后，多种心肌保护手段都能够主动募集信号转导通路，其中就有PI3K-AKT信号转导通路[8]。PI3K-AKT信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路，是许多生命活动中的关键信号分子[9]。P13KAKT是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要信号转导途径，通过AKT磷酸化，诱导抗凋亡或下调促凋亡的蛋白表达而抑制凋亡。因此，P13K-AKT是细胞存活和抗凋亡的关键性途径。AKT是PI3K下游的最重要的靶酶，负责传递PI3K的始动信息。因此，有研究认为心肌保护作用的机制有一部分是依赖于AKT的磷酸化[8，10]。而本实验所测指标P-AKT/AKT升高说明PI3K-AKT通路被激活，说明这一通路可抑制细胞凋亡，从而减轻心肌细胞的损伤，其机制可能与这一通路调控Caspase-3、Caspase-8以及Bcl-2家族参与抗心肌细胞凋亡的保护作用相关[11]；同时，该通路也是细胞存活的重要途径，参与激活下游JAK2、STAT3/5等而发挥作用[12]。

综上，EPO对CHF模型大鼠具有抗心室重构、改善心肌凋亡的作用，这与相关研究结论一致[13-14]。EPO促进AKT蛋白的磷酸化，从而发挥抗凋亡作用，将作为改善心力衰竭患者心功能的一个新靶点，但其作用机制有待进一步研究。

（图1、2见插页）

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（2015-06-15收稿2015-08-31修回）

（本文编辑李鹏）

Effects of erythropoietin on apoptosis and expression of AKT in rats of chronicheart failure

XU Wei1，CHEN Yongquan1，WU Jinlei1，LIU Xin1，CHEN Ximing1△, CHEN Shengqiang2，SUN Weiwen2
1 Department of Cardiology, The Third Affiliatedhospital of Guangzhoumedical University，Guangzhou 510150，China；2 The Second Affiliatedhospital of Guangzhoumedical College
△Corresponding Author E-mail：13903004891@163.com

Abstract：Objective To investigate the effects of erythropoietin (EPO) onmyocardial apoptosis and protein kinase B (AKT) expression in rats of chronicheart failure (CHF).Methods Thirtymale adult SD rats were randomly divided into two groups, sham-operated (Sham) group (n = 6) andmodel (Model) group (n = 24).The abdominal aortic coarctation was used to build CHFmodel.Sixteen survived rats after operation were randomly divided into two groups including EPO group and con⁃trol (Control) group.EPO group was received 3 000 U/kg EPO intraperitoneal injection 3 times /week for 4 weeks, and Sham group and Control group were received same volume of normal saline.The echocardiography was used to evaluate cardiac function after 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks of treatment.After 12 weeks, all rats were sacrificed after 24h fasting.The cellmorphology andmyocardial apoptosis were observed, and apoptosis index (AI) was calculated.Myocardial P-AKT /AKT pro⁃tein expression was detected by Western blot assay.Results Echocardiography showed that ventricularhypertrophy was found inmodel group after four weeks,heart failure 8 weeks.Compared with Control group, left ventricular ejection fraction (LVEF) was significantlyhigher after EPO intervention for 4 weeks (P < 0.05), systolic interventricular septum thickness (IVSs), end-systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWs), diastolic interventricular septum thickness (IVSd), af⁃ter left ventricular end-diastolic wall thickness (LVPWd) were significantly lower (P < 0.05).The value of AI was significant⁃ly lower in EPO group than that of Control group (23.87%±1.45% vs 35.58%±2.81%, P < 0.01).The OD value of P-AKT /AKT was significantly decreased in Control group (0.35±0.06) than that of Sham group (0.81±0.17), the value was significant⁃ly increased in EPO group (1.61±0.16) than that of Control group (P < 0.01).Conclusion EPO can improveheart function，inhibitmyocardial apoptosis，and promote pro-phosphorylation of AKT in rats with chronicheart failure.

Key words：erythropoietin；heart failure；cardiac apoptosis；AKT protein

通讯作者△E-mail：13903004891@163.com

作者简介：许卫（1987），男，在读研究生，住院医师，主要从事冠心病防治相关研究

基金项目：广东省科技厅项目（2013B022000103）

中图分类号：R541.6

文献标志码：A

DOI:10.11958/59073

作者单位：1广州医科大学附属第三医院心内科（邮编510150）；2广州医科大学附属第二医院