基于夹心免疫分析法创建检测甲胎蛋白和癌胚抗原的高灵敏度微粒子酶促化学发光

潘淑玲

【摘要】临床检测中，通常在诊断疾病时会结合肿瘤标记物相关数据加以判断，只是检测单个肿瘤标记物无法精确诊断该疾病。所以，同时检测多种肿瘤标记物对精确诊断癌症具有很大促进作用。相比于以往分免疫分析，夹心免疫分析法具有较高样品分析通量、较低样品消耗以及较短分析时间。很多文献都详细综述了夹心免疫分析本身的发展历程。本研究主要基于夹心免疫分析法创建检测癌胚抗原与甲胎蛋白的高灵敏肝微粒子酶促化学发光作一综述。

【关键词】夹心免疫分析法；甲胎蛋白；癌胚抗原；高灵敏度微粒子酶；化学发光

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）01-0023-02

1前言

癌胚抗原（CEA）与甲胎蛋白（AFP）是目前为止相对比较肯定的两个肿瘤标志物，现阶段已经在诊断临床肿瘤中被广泛应用，检测两者的方法主要包括IRMA（免疫放射分析）法、RIA（放射免疫分析） 、 EIA（固相酶联免疫测定）法等[1-2]。癌症是威胁者全人类健康的一种疾病，检测肿瘤标记物在临床诊断癌症与康复评估患者病情中发挥中重要作用。因为CEA特异性分子识别的选择性比较高，所以夹心免疫分析法逐渐成为临床定量分析肿瘤标记物的关键检测方式。免疫传感器具有较好选择性、较高灵敏性，而且便于操作，结合其它转能器后发展更为迅猛[2]。多种标记物模式区间分辨模式采用夹心免疫分析法的研究报道也比较多。化学发光（CL）的优势在于检测速度快、灵敏度比较高、装置简单以及选择性好等，目前已被广泛应用于多组分分析中。例如，杜平等[3-4]学者联用化学发光技术和芯片技术，能够平行检测人体血清中的CA15-3、CA125、AFP、CEA及PSA等肿瘤标记物，用于检测数千名癌症患者的血清，其综合灵敏度高达71.2%。林洁华[5]等在多组分肿瘤标记物中应用底物区带分辨技术进行连续化学发光检测，并以CEA、AFP等为目标分析物，抗体捕获固体化膜材料为聚醚噻吩，创建以双通道分辨技术为基础的流通式免疫分析机制，对CEA、AFP进行联合检测的检出限分别是0.25μg/L、1.5μg/L[6-11]。本研究 对CEA、AFP两组分肿瘤标记物进行CL-EIA（化学发光酶联免疫分析法），免疫反应器分别是被了CEA单克隆抗体与AFP单克隆抗体的在医院中比较常见的微孔板。采用夹心式免疫分析法与流动注射化学发光相结合的方式，在串联可移动免疫流通检测池中对CEA、AFP进行同时检测。本研究主要对夹心免疫分析法创建检测癌胚抗原与甲胎蛋白的高灵敏肝微粒子酶促化学发光作一综述。

2实验研究

2.1检测仪器及检测试剂

本研究的检测装置为可移动自制检测池、固定单克隆抗体微型检测池各2个，系统管道流路材料为1.0mm内径的硅胶管与0.8mm内径的聚四氟乙烯管。通过美国贝克曼化学发光仪对自微型检测池中所映射的化学发光信号进行检测，光路开关为微型检测池内部不透光部分，与分光光度计拉杆较为类似，拉动微型检测池，确保不同微型检测池能够在化学发光分析仪电倍增管之上，对微型检测池发光强度进行检测[12-15]。CEA与AFP诊断试剂盒包含浓度不同的很多标准抗原、预先固定单克隆抗体的微型检测池和辣根过氧化物酶标记。由上海化学试剂厂提供的二氧化氢与德国生产的鲁米诺，以二次蒸馏水为实验用水[16-18]。

2.2夹心免疫分析法

单通道分离检测CEA、AFP的流程如图1所示，除了切换微型检测池与手动控制可移动检测池床的光路开关，其它步骤都是电脑自动控制。第一步，将泵P2开动，CEA、AFP混合样品由管路d泵向进样阀e流入，以此完成采样，切换进样阀e至载液管路c，载液管路c将混合样品500μL输送至微型检测池中[19-20]，同时进行40min的停留孵育，确保阀e的阀位保持不变，通过载液管 c中的载液对微型检测池进行3min的冲洗，对阀e位加以切换，再由管路d将混合抗体泵入，通过进样阀e采集500μL的样品，由管理c载液带入检测池，进行20min的停留孵育，用微型检测池固定酶标抗体与混合样品以完成夹心免疫分析反应。各微型检测池的体积在250μL左右[21-22]。通过管路c中的PB（0.1mol/L）对微型冲洗池进行3min的冲洗，之后开动泵1，通过管理b、a混合二氧化氢与鲁米诺溶液，注入溶液在微型检测池中，拉动检测池拉杆，对光路开关进行控制，放检测池在贝克曼化学发光仪检测窗口之上，以此对微型池中的酶促化学发光信号进行检测。

3结果

3.1 CEA、AFP的免疫分析

最佳研究条件下，CEA、AFP的免疫分析曲线见图2，检测CEA、AFP的线性范围是1.25～40.0μg/L、1.25～50.0μg/L，其相关系数分别是0.999、0.998，检出限分别是1.00μg/L、1.06μg/L，ELISA免疫分析试剂盒诊断指标是5.0μg/L、25.0μg/L，因此本研究的免疫传感器系统具有非常高的灵敏度，满足应用需求，血清肿瘤样品含量比较高，可通过0.1mol/LPBS加以稀释后方可检测。

图2：CEA、AFP的免疫分析曲线

3.2交叉反应评价

多重免疫分析中需要考虑的一个重要因素就是交叉反应。本研究中，由于CEA、AFP在分离通道中检测，因此，能够避免反应物扩散效应所产生的交叉干扰。而肿瘤标记物与抗体的交叉反应时对多重免疫反应可靠性产生影响的唯一因素。为对CEA、AFP的交叉反应进行研究，将CEA添加在AFP标准溶液中，并和HRP-anti- AFP进行孵化反应实验。研究结果发现，化学发光信号只提升1.5%，并没有影响到AFP测定。所以，在单次实验中，两种肿瘤标记物能够同时检测，而且具有非常小的交叉反应。

3.3重现性与精密度

平行实验是通过检测池与载流冲洗管路对固定化抗体微孔板进行更换后，通过浓度相同的CEA、AFP进行重复性测定，9次重复试验后发光强度并未出现明显改变。CEA、AFP标准偏差分别为3.2%、2.3%，由此可见，该实验具有非常好的重现性与精密性。

4讨论

传统超微量免疫分析的不足之处在于缺乏稳定性，无法满足临床需要[23]。因为保存条件苛刻、放射性同位素示踪剂衰变、自分解变形失活等相关因素，所以在检测单样品时，通常要做出标准曲线，并将其当作测量的重要依据。实际上可以在实验室中应用的化学发光免疫分析体系属于吖啶酯标记的发光、鲁米诺-H2O2-HRP与乙烷衍生物，吖啶酯体系属于Ciba-corning专利产品，其主要优势在于具有较高灵敏度，但是具有较短的发光时间与较差的重复性，加样需要原位注射，具有较高的贝克曼化学发光仪自动化程度要求。HRP具有价格便宜、活性高、稳定的优势，所以在酶免疫分析中应用最为广泛，但是鲁米诺具有不稳定性，很容易氧化发光，造成所检测的特异性与灵敏度不够理想，二氧乙烷衍生物-碱性磷酸酶发光体系是目前最为灵敏的发光分析系统，在检测标示物ALP限度方面达到10-21mol。然而，因为高淳ALP价格比较昂贵，螺旋金刚烷发光底物供应渠道不产，高质量国产低成本的雌性微珠缺乏等因素，导致该先进技术很难国产化。由于EIA方法学因素，所以无法实现完全定量[24-28]。而基于夹心免疫分析法创建对癌胚抗原与甲胎蛋白进行检测具有非常高的灵敏度，而且在单次实验中，两种肿瘤标记物能够同时检测，而且具有非常小的交叉反应。因此该方法值得在相关癌症病理学检测中应用与推广。

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