乙型肝炎病毒多聚酶/反转录酶区耐药突变研究进展

赵 丽，苏何玲，刘 妍，徐东平

1.桂林医学院，广西 桂林 541004； 2. 解放军三〇二医院临床研究管理中心

乙型肝炎病毒多聚酶/反转录酶区耐药突变研究进展

赵 丽1，苏何玲1，刘 妍2，徐东平2

1.桂林医学院，广西 桂林 541004； 2. 解放军三〇二医院临床研究管理中心

目前临床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物是核苷(酸)类似物(NAs)，但长期使用可导致HBV发生基因突变引起耐药，导致治疗失败。HBV多聚酶/反转录酶(RT)区是NAs药物治疗作用的靶点，公认的耐药突变也都发生在RT区内。不同NAs药物的耐药形式往往不同，但也存在交叉耐药和多重耐药突变形式。深入观察抗病毒治疗过程中耐药突变及演变规律，分析各种突变形式的表型特点及其与临床表现的关系，用灵敏方法对患者病毒RT区耐药相关突变进行动态监测，早期发现HBV耐药，合理进行挽救治疗，对慢性乙型肝炎治疗具有重要意义。

乙型肝炎病毒; 耐药；突变；抗病毒治疗

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一个严重的全球性的公共卫生问题。目前治疗HBV的药物有两大类：α-干扰素和核苷(酸)类似物(NAs)。NAs分为核苷类似物和核苷酸类似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)和恩替卡韦(ETV)，后者包括阿德福韦酯(ADV)和富马酸替诺福韦酯(TDF)等，NAs由于抑制病毒复制作用较快、服用方便、副作用低而广泛用于临床治疗，但需长期服用可产生病毒耐药[1]。本文主要就目前NAs治疗过程中出现的耐药研究进展，结合课题组研究结果，作一概述。

1 核苷(酸)类似物耐药机制

HBV是一种小分子,部分双链环状的DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒属。在HBV复制过程中，由于其高复制率及RT校对功能的缺乏，具有高变异特性。虽然NAs抑制HBV复制的效果较强，但对HBV复制的原始模板共价闭合环状DNA(cccDNA)无直接作用，需长期使用，可引起病毒发生突变，其中对药物压力适应性强的变异病毒可获得选择性扩增，产生耐药突变，导致临床抗HBV治疗失败[2-3]。目前抗HBV药物NAs作用靶点均在病毒的多聚酶/逆转录酶(RT)区，已知的耐药相关突变也均位于RT区。NAs耐药分为原发耐药突变和继发耐药突变(又称为复制力补偿突变)两种。前者直接引起病毒对药物敏感性的下降，后者的主要作用是恢复因原发耐药突变引起的自然复制力下降。HBV发生耐药突变后，可先后引起病毒学突破和生化学突破，在诊断病毒耐药突变过程中，根据检测方法的不同，将HBV耐药分为基因型耐药和表型耐药，基因型耐药指的是在抗病毒治疗过程中检测到公认的与NAs相关的HBV耐药基因突变；而表型耐药是指在体外分别将带有野生和耐药相关变异的HBV基因组重组质粒转染支持HBV复制的细胞中(如HepG2)证实，并加入梯度药物，比较药物的敏感性，出现与基因耐药相关的抗病毒药物敏感性降低，以半数有效浓度( EC50) 表示[4]。除此之外，NAs耐药突变的产生与患者的药物代谢差异及免疫状态等方面也存在一定关联。

2 LAM相关耐药突变

LAM属于胞嘧啶类核苷类似物，作为第1个获得美国FDA批准的口服抗病毒药物，它的出现给广大的HBV感染者带来了福音。但作为第1代NAs类抗HBV药物，LAM的耐药基因屏障最低，病毒的相关耐药发生率最高。联合使用其他核苷(酸)类似物，如LAM+ADV可显著降低其耐药发生的风险[5]。目前发现LAM原发耐药公认的位点是YMDD即聚合酶区rtM204V/I，前者通常伴随L180M继发耐药突变，而后者常单独出现或伴随rtL80I继发耐药突变，rtM204V和rtM204I突变HBV对LAM敏感性的下降通常超过500倍。除此之外，有报道过其他形式的LAM相关突变，我们课题组[6]对发生rtL229突变的慢性乙型肝炎患者的样本HBV进行测序，发现一些患者出现rtM204I+rtL229突变株共存，通过构建体外rtL229有关表达载体，经LAM处理，发现rtL229F突变伴随rtM204I出现在LAM的治疗过程，对LAM敏感性影响不大，但rtL229F可以恢复rtM204I突变株的复制能力，证实rtL229F是LAM耐药相关的继发突变。我们还发现rtM204Q突变是一种新型的LAM耐药突变模式，在对大样本患者筛查中发现，有7例LAM耐药患者出现rtM204Q单独突变，或联合经典的LAM耐药突变，表型分析结果显示rtM204Q的LAM EC50与野生株增加了78倍，是一种新的LAM原发耐药突变模式，由于rtM204Q突变对ADV具有敏感性，因此在临床上除了可以采用TDF挽救治疗方案外，也可以采用ADV或ADV+LAM挽救治疗方案[7]。

在长期的用药研究中，针对慢性乙型肝炎患者发生LAM耐药的补救治疗方案的选择十分重要。2012年的一项研究显示，LAM耐药患者采取的4种补救治疗方案中，经ADV+ETV补救治疗后耐药率最低，但在我国临床上最常使用的却是ADV单一疗法[8]。同时由于YMDD突变株在慢性感染治疗过程中易引起耐药性，因此在患者发生病毒学和生化突变前检测出该病毒株突变模式有助于临床及时调整和提高治疗效果。LAM耐药型与野生型病毒一样具有水平传播力，一个直接的证据是在少数未接受NAs治疗的急性乙型肝炎患者样本中检出了LAM耐药株。

本课题组Xu等[9]对201例未接受过NAs治疗的急性乙型肝炎患者血清进行分析，通过直接测序并通过克隆测序证实14例阳性耐药患者中有11例出现了LAM耐药突变模式rtM204I/V。此外Baxa等[10]也在未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中检测到少数患者发生耐药突变。这些研究均表明LAM耐药株具有水平传播能力。

3 ADV相关耐药突变

ADV是一种中效的抗HBV药物,其基因耐药屏障也较低，在我国广泛用于LAM耐药患者和慢性乙型肝炎的初治过程中,HBV感染患者接受ADV 治疗 1、2、3、4、5 年 HBV 累积耐药率分别为 0、3%、11%、18%、29%，一旦发生耐药，临床则考虑换药或与其他核苷类药物联合治疗[11]。目前，公认的经典的ADV耐药突变为rtA181V和rtN236T，其中rtN236T突变主要发生在B基因型HBV感染中，而且发现大部分ADV耐药突变都是两个或两个以上[12]。此外，有研究提示还存在其他ADV相关耐药突变形式。本课题组Liu 等[13-14]通过大样本临床耐药检测分析、临床随访监测结合表型耐药分析，发现并鉴定了两种新的ADV原发耐药突变模式，即rtA181S和rtN236V，其中通过测序分析大样本的慢性乙型肝炎患者，检出带有rtA181S突变的患者占有率为0.53%(98/18 419)，其在经ADV 治疗过的5 344 例患者中占0.86%(46/5 344)，通过TA 基因克隆分析RT区，检测发现在发生病毒学突破时有6 例患者均出现rtA181S 突变，表型耐药分析rtN236T、rtA181S、rtA181V 和rtA181S+rtN236T突变株的EC50分别是野生株的7.9倍、3.7倍、5.6倍、9.8倍，提示rtA181S是一种中等ADV相关耐药突变。由于rtA181S突变对LAM、ETV、TDF 3种药物敏感，在2例发生rtA181S突变的患者中采取ETV和LAM+ADV挽救治疗方案，发现ETV和LAM+ADV用药能够有效的抑制病毒复制，但LAM+ADV联合用药不能减少rtA181S的突变比例，治疗过程中rtA181S突变株持续存在，提示ETV挽救治疗可能更有效。同年课题组在6例ADV难治性患者中检测到rtN236V突变，表型耐药分析显示rtN236V突变是一种新型少见的ADV耐药突变，其与rtA181S突变类似。

此外，本课题组[15]对18 419例患者分析发现rtI233V突变与ADV耐药相关，测序检测出rtI233V突变在经ADV治疗和未接受治疗的患者中分别为38/344、8/13 075(P<0.01),克隆测序发现8例经ADV治疗过的患者在发生病毒学突变时均检测到rtI233V±rtA181V/rtN236T突变存在，表型耐药显示rtI233V、rtN236T、rtI233V+N236T突变株对ADV的耐药倍数是野生株的2倍、6.82倍、5.28倍，在ADV用药过程中rtL233V、rtN236T、rtI233V+N236T突变株的复制能力与野生株相比分别为97.5%、30.2%、69.7%。发现rtI233V突变虽然对ADV的敏感性低，但能够恢复rtN236T突变株的复制能力，提示rtI233V突变可能是一种新的ADV相关的替换突变。由于rtA181S、rtN236V、rtI233V 3种突变均对LAM、ETV、TDF敏感，在针对发生rtA181S、rtN236V、rtI233V突变的ADV耐药患者中，临床均可以使用ETV挽救治疗，抑制病毒复制，使ALT恢复至正常水平。

根据最新的慢性乙型肝炎防治指南[16]在针对ADV耐药治疗失败的患者，可以采取以下两种挽救方案:(1) 针对发生ADV耐药，但之前未使用LAM的患者，可以换用ETV或TDF; (2) 针对治疗LAM/LdT耐药时出现的ADV耐药患者，可以换用TDF或ETV+ADV。

4 ETV相关耐药突变

ETV是一种高基因屏障NAs药物，是所有抗HBV药物中发生耐药最低的。据统计其在初治患者中6年耐药率仅1.2%，但在作为LAM耐药患者的挽救治疗中6年耐药率达60%[17]。目前认为ETV耐药是在LAM耐药基础上出现的，当出现LAM敏感的突变位点时，病毒对ETV的敏感性会下降[18]。ETV耐药多在rtL180M、rtM204I/V的基础上出现3个以上的位点突变，如rtT184A/G/F/I/L/S、rtS202C/G/I或rtM250I/L/V。此外，Hayashi等[19]从对1例ETV难治性患者的血清样本中发现了2种可能与ETV耐药相关的新型突变rtI163V和rtA186T的存在,该突变伴随LAM耐药出现。将发生病毒学突破的样本血清接种到小鼠中，通过构建小鼠模型，动态监测证实rtA186T突变与ETV耐药密切相关，能够降低HBV聚合酶对ETV的亲和力，而rtI163V突变与ETV耐药不相关。上述研究均表明ETV耐药与LAM耐药相关，这可能对指导临床联合用药有帮助，但是否存在其他ETV耐药有待研究。

在长期用药研究中，临床上长期使用ETV抗病毒治疗安全有效，通过对慢性乙型肝炎患者使用5年的ETV疗效观察，发现除了 TDF以外，ETV相比其他抗病毒药物对HBV DNA的抑制作用更强，其耐药率低，因此推荐ETV作为第一线抗病毒药物治疗[20]。

5 TDF相关耐药突变

TDF是与针对人免疫缺陷病毒1型和HBV的NAs药物。TDF是目前耐药基因屏障最高的药物之一，其抗病毒治疗效果强，几乎不发生耐药。迄今为止，尚未有证实的有关TDF耐药突变形式存在。以往有研究提出rtA194T[21-22]为TDF耐药相关突变，但未获得公认。Murakami等[23]在有关TDF对发生HBV耐药克隆的影响的研究中，发现TDF对rtA181T/ N236T的敏感性有所降低，TDF敏感性因HBV基因型和耐药性HBV克隆的不同而不同。此外，最新研究发现经TDF治疗后，约60%的病毒血症患者中检测到rtD263E突变存在，推测该突变可能是一种TDF应答不佳相关突变形式[24]。

6 NAs多重耐药突变

多重耐药突变是指在HBV基因组上同时出现了针对核苷类和核苷酸类抗HBV药物的耐药突变。目前，随着NAs抗病毒药物的广泛使用，LAM、ADV、ETV、TDF几代药物频繁应用于临床慢性乙型肝炎感染的治疗过程，其中LAM、ADV作为低耐药基因屏障药物，其耐药发生率呈上升趋势，在针对耐药突变而采取的挽救治疗或其他原因而应用的多种NAs治疗的慢性乙型肝炎患者体内，可能存在针对多种药物联合治疗而引发的耐药突变。

本课题组Liu等[25]在回顾性分析大样本慢性乙型肝炎患者中，在经LAM、ADV、ETV及LAM+ADV联合治疗的患者体内检测到rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、rtL180M+S202G+M204V+N236T两种带有LAM和ADV耐药的多重耐药突变的病毒株，该病毒株对LAM、ETV、ADV单一治疗和LAM+ADV联合治疗的敏感性下降。在此之前，本课题组[26]报道了1例发生多重耐药的慢性乙型肝炎患者，通过动态监测患者NAs用药和多重耐药发生的演变过程，发现ETV耐药不仅在LAM耐药突变基础上出现，而且能够加速LAM耐药突变的出现。在经LAM、ADV、ETV序贯治疗过程中患者由单一耐药突变发展到多重耐药突变。克隆测序共检出33种病毒突变株，其中3种为多重耐药突变株，即rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、L180M+S202G+M204V+N236T和L180M+A181V+S202G+M204V的存在。我们通过对大样本的测序筛查，在40例患者样本中共检出了11种多重耐药突变形式，采用ADV+ETV治疗对多重耐药HBV感染有较好的抑制效果[27]。Kim 等[28]研究经LAM、ADV、ETV单一治疗和LAM+ADV挽救治疗后发生多重耐药突变的患者，分析6例接受过LAM+ADV挽救治疗的患者，通过体外克隆实验，发现大部分多重耐药突变发生在不同的基因组，提示LAM+ADV补救治疗效果可能与多重耐药株突变基因位点无关，而取决于药物潜在的低抗病毒阻力，因此认为有效的联合用药对多重耐药患者是一种有效的补救治疗。

当前，随着NAs在临床抗病毒治疗过程中的广泛使用，针对HBV感染患者的治疗方案也发生了很大的变化，从以往一用药到现在联合用药。虽然在一定程度抑制了疾病的进展，取得一定的临床疗效。但由此引发的耐药突变问题变得也更为复杂，同时带来的经济问题也给广大患者造成了一定负担。为此，需要临床医生提高对HBV耐药发生的认识，以采取有效的应对措施减少耐药发生，提高抗HBV治疗效果。

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(责任编辑：王全楚)

The progress of drug resistant mutation in polymerase/reverse transcriptase of hepatitis B virus

ZHAO Li1, SU Heling1, LIU Yan2, XU Dongping2

1．Guilin Medical University, Guilin 541004; 2.Center for Clinical Research and Translational Medicine, 302 Hospital of PLA,China

Currently nucleos (t) ide analogs (NAs) are most common anti-hepatitis B virus (HBV) drug used in clinic. However, the requirement of long-term use may lead to treatment failure due to drug-resistant mutation of the virus. As HBVpolymerase/reverse transcriptase is the target for anti-HBV NAs, drug-resistant mutations occur in this region. Different NAs usually have individual mutational patterns, while cross and multiple drug-resistant mutational patterns also exist. It is important for valid management of chronic hepatitis B by carefully observing occurrence and evolution of drug-resistant mutants during anti-HBV therapy, using sensitive assays for early detection and dynamical monitoring of viral resistance, and therefore conducting reasonable rescue therapy on time.

Hepatitis B virus; Drug resistance; Mutation; Antiviral therapy

国家自然科学基金面上项目(81371852)

赵丽，硕士研究生，研究方向：主要从事乙肝病毒基因变异方面的研究。E-mail: zhaoli302@sina.cn

徐东平，研究员，E-mail: xudongping302@sina.com；刘妍，副研究员，E-mail:Liuyan5360@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.029

R512.6+2

A

1006-5709(2016)11-1317-04

2016-03-17