慢性根尖周炎感染根管内粪肠球菌检测和中间普氏菌基因多态性研究

徐芳

慢性根尖周炎感染根管内粪肠球菌检测和中间普氏菌基因多态性研究

徐芳

目的 探讨慢性根尖周炎感染根管内粪肠球菌检测和中间普氏菌基因多态性特点。方法 选取需根管再治疗和未经根管治疗的慢性根尖周炎患者各20例，对根管内细菌样本采集，行DNA提出，检测粪肠球菌，并分析中间普氏基因多态性。结果 需根管再治疗的患者E.f检出11例，检出率为55%；未经根管治疗的患者E.f检出2例，检出率为10%，差异有统计学意义（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，经AP-PCR电泳对中间普氏菌行基因多态性分析，发现各样本中均各有1种基因型。结论 在原发慢性根尖周炎病例感染根管中，粪肠球菌有较低检出率，而在再治疗病例中，检出率明显增高，与根管治疗时再感染可能相关。同时，中间普氏菌具基因多态性，可为临床治疗提供参考依据。

慢性根尖周炎感染；根管内粪肠球菌；中间普氏基因多态性

根尖周炎为临床口腔科领域一种常见的慢性感染性病变，由起源自牙髓病的致病因素引发。根管治疗术是现阶段已被证实的最有效治疗本病的方案，在无菌条件下，依据操作原则实施，可达85%～96%初次成功率[1]。针对少部分无效的患者，根管充填后在根尖周或根管内残留的微生物感染是主要引发治疗失败的原因，检测治疗失败的患者根管内细菌，如粪肠球菌（E.f），并行中间普氏菌基因多态性研究，可为临床治疗提供参考依据，本研究探讨慢性根尖周炎感染根管内粪肠球菌检测和中间普氏菌基因多态性特点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取选取江西省景德镇市牙病防治所口腔科2014年5月～2015年5月收治的40例慢性根尖周炎患者，其中需根管再治疗和未经根管治疗各20例，需根管再治疗男14例，女6例，年龄19～45岁，平均（28.5±2.5）岁，未经根管再治疗男15例，女5例，年龄19～46岁，平均（28.9±2.4）岁，2组间基线资料比较差异无统计学意义。患者对本次实验均知情同意，将患全身系统疾病，根尖有窦道者排除。

1.2 方法 （1）采集样本：患牙上橡皮障，将所有修复体、充填体去除，用75%酒精对患牙消毒，取蒸馏水冲洗。需根管再治疗的患牙，应用G钻将冠2/3的根充材料去除，根尖1/3根充材料取出，在1 mL Ringer′液管中放置。若有液体自根管渗出，可取无菌纸捻插入，深度与根尖孔距离1 mm，在根管内纸捻停留1 mm取出，重复3次，在1 mL Ringer′液管放入所有纸捻。（2）DNA提取：提取国际标准菌株：E.f、中间普氏菌（P.i,ATCC25261）。（3）PCR分析：取1.5%琼脂糖凝胶对样本

PCR扩增产物电泳、拍照，对E.f检出率计算，并分析中间普氏菌基因多态性。中间普氏菌基因多态性分析方法：用中间普氏菌特异引物PCR对克隆样本检测，结果为阳性者，检测菌株基因多态性，采用随机引物扩增，取10μL产物1%琼脂糖凝胶电泳，成像应用凝胶原像分析仪分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

需根管再治疗的患者E.f检出11例，检出率为55%；未经根管治疗的患者E.f检出2例，检出率为10%；差异有统计学意义（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，经AP-PCR电泳对中间普氏菌行基因多态性分析，发现各样本中均各有1种基因型。

3 讨论

分析口腔科慢性根尖周炎病例采用根管治疗结果失败的原因，与患者感染根管内微生物紧密关联。失败病例中，有66.7%～72.0%的根管微生物检出率。Siqueira JF Jr等[2]研究示，在治疗失败病例患牙根管内对微生物提取，与未经治疗坏死牙髓中提取的微生物明显不同。未治疗的根管系统以典型的多微生物混合感染为表现，以专性革兰阳性及阴性厌氧菌为优势菌。治疗失败的病例，为单一菌种感染样本占约1/3，兼性厌氧菌比例有所增加，向优势菌群转变，而革兰阳性菌因各种机械化治疗措施的实施，有更强抵抗性，在检出细菌中占主导[3-4]。根管治疗失败的患牙，常有特征性种属细菌分离出，其中肠球菌的存在已引起临床重视，因其较少在未用治疗方案的感染根管中出现，而感染根管内肠球菌E.f最常检出，占80%～90%。

E.f为一种革兰阳性兼性厌氧菌，属重要的人类机会感染病原菌，也属人体正常菌群。其常在人类的口腔、阴道、肠道寄居，但口腔分布较少。在再感染根管病例中，E.f是最常被检出的细菌，初次治疗的病例中偶被检出，根管治疗失败的病例中，检出率有所增高。本次选取的再治疗患者，有高达55%的E.f检出率，明显高于未经治疗者[5]。表明E.f为根管治疗时被带入根管内。研究示，当氢氧化钙液pH达11.5时，可杀死99.99%的

E.f，但临床现用的氢氧化钙pH多仅可达9.5%～10.0%，E.f无法完全被消灭。

本研究所选样本在根管填充时，未将氢氧化钙作为根管内用药，仍有较高的E.f检出率，与前次治疗医生的操作技术相关。本次选取的需根管再治疗的20例慢性根尖周炎样本，大部分前次采用根管方案治疗时有缺陷存在，如根管成形与清理不足、根充欠填、充填物继发龋坏等。未彻底清理和封闭根管系统，增加了E.f渗入或残留风险。病原菌在根管中匿藏，可经未严密封闭的部位在渗漏的组织液中获取生长所需营养，当入侵至根尖周组织，可对根尖周病变的发生和发展促进[6-7]。E.f所具有的其它特性与其高检出率也有较紧密相关性。E.f对多种杀菌药物及机械化学预防具广泛抵抗力。有针对感染牙模型展开的研究示，取4%NaCIO应用，作用5 min，可达60%对E.f的清除率。分析原因，是杀菌药物与在牙本质小管内存在的目标菌无法直接接触。有学者将E.f在离体牙根管内植入，应用NaCIO溶液冲洗后显示，显著降低了E.f数量，但7 d后再行观察，再感染根管可达80%，提示此细菌有较快的形成再感染的速度。E.f可在治疗后未检出其他协作菌的根管内生长，在治疗失败的患者中，表现为单一E.f感染的病例约占30%。此外，生物膜形成是治疗后E.f长期在根管内存留的主要原因，生物膜中E.f有更复杂的代谢过程，且其对营养要求不高，繁殖迅速，可对根尖区缺氧环境耐受，进而较难达到彻底清除目标，极易引发根管治疗失败。

中间普氏菌（P.intermedia）以蛋白水解酶、脂多糖、囊泡、凝集素等为主要致病因子，是一种产黑色素、革兰阴性专性厌氧菌。有研究显示[8]，其与牙周疾病的发生关联密切，为主要可疑致病菌。在慢性根尖周炎感染根管中有较高检出率，表明其与根尖周感染可能也相关。依据纤毛类型差异，可将其按20种基因型划分，在临床收治的慢性牙周炎病例牙周袋中，有P.intermedia17、W729等4种基因型检出，但根尖周感染中，中间普氏菌有无基因多态性存在，不同基因型作用如何，本研究选取慢性根尖周患者，在患牙感染根管中，应用随机引物RCR技术观察中间普氏菌基因多态性，结果显示，所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，经AP-PCR电泳对中间普氏菌行基因多态性分析，发现各样本中均各有1种基因型。慢性根尖周炎病发过程除与致病菌种类相关外，还与致病菌毒力因子有一定相关性，而基因型不同的菌株在毒力致病性上可能存有明显差异，即存在致病菌基因多态性。本研究不同的病例有不同基因型，体现了基因多态性，可为慢性根尖周炎感染中间普氏菌致病机制的研究提供依据。

综上所述，在原发慢性根尖周炎病例感染根管中，粪肠球菌有较低的检出率，而在再治疗病例中，检出率明显升高，与根管治疗时再感染可能相关。同时，中间普氏菌具基因多态性，可为临床治疗提供参考依据。

[1] 樊明文，周学东.牙体牙髓病学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2008：200.

[2] Siqueira JF Jr,Rocas IN,Alves FR,et al.Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals:A molecular inverstigation[J].J Endod, 2004,30(9):638-643.

[3] 唐子圣，曹慧敏，刘正，等.应用16 SrDNA结合膜芯片检测3种产黑色素牙周牙疑致病菌[J].上海口腔医学，2006，15（3）：290-293.

[4] 孙慧斌，邓婧，王云，等.根管治疗失败病例根管内微生物的分子生物学检测[J].实用口腔医学杂志，2010，26（1）：96-99.

[5] 魏玉芬.不同处理方式对急性根尖周炎的疗效观察[J].当代医学，2011，17（35）：106-107.

[6] 闫培芳，梁景平，李超伦，等.慢性根尖周炎根管中8种厌氧菌检出分析[J].口腔医学，2006，26（4）：250-252.

[7] 张英姿，曾建军.碘仿糊剂与Vitapex治疗难治性根尖周炎临床疗效观察[J].当代医学，2010，16（22）：46.

[8] Lyer D, Anaya-Bergman C,Jones K,et al.AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rech repeat internalin-like protein[J].Infec Immun,2010,78(6): 2385-2396.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.30.029

江西 333000 江西省景德镇市牙病防治所（徐芳）