IL-6基因634C/G多态性与糖尿病周围神经病变相关性研究

安新焕，丁俊彩，武彦峰，梁干雄

(1.中山市人民医院内分泌科，广东 中山 528400；2.中山市人民医院儿科，广东 中山 528400；3.北京市理化分析测试中心，北京 100094)

IL-6基因634C/G多态性与糖尿病周围神经病变相关性研究

安新焕1，丁俊彩2，武彦峰3，梁干雄1

(1.中山市人民医院内分泌科，广东 中山 528400；2.中山市人民医院儿科，广东 中山 528400；3.北京市理化分析测试中心，北京 100094)

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)基因启动子区-634C/G多态性与广东地区汉族人群糖尿病周围神经病变(DPN)的关系。方法 收集2014年1月至2015年1月我院收治的125例2型糖尿病无周围神经病变患者(DPN0组)，83例2型糖尿病周围神经病变患者(DPN组)及101例健康对照者(NC组)，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测其IL-6基因启动子区-634C/G多态性，比较分析各组间基因型频率、等位基因频率以及相关临床资料。结果 DPN0组的GG基因型频率(16.0%)明显高于NC组的4.0%(P＜0.05)，DPN0组(34.4%)、DPN组(33.1%)的G等位基因频率均明显高于NC组的22.3%(P＜0.05)，但DPN0和DPN两组间G等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 IL-6基因启动子区-634 G/G基因型不是广东汉族人群DPN发生的遗传危险因素，但G等位基因可能是DPN发生的遗传危险因素之一。

白细胞介素-6；基因；启动子区；多态性；糖尿病周围神经病变

糖尿病性周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者最常见的慢性并发症之一。10年以上糖尿病病程的患者常有明显的临床糖尿病神经病变，2001年对国内住院患者调查发现，61.8%的2型糖尿病患者并发神经病变[1]，国外学者报道24.7%～81.8%的糖尿病患者发生周围神经病变[2]。IL-6是一种炎性细胞因子，可促使氧化应激增强，而氧化应激及低度炎症状态是DPN发生的机理之一，本文旨在检测IL-6基因-643C/G的多态性，以探讨在中国广东地区汉族人中此基因多态性与DPN之间是否有关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年1月至2015年1月我院收治的2型糖尿病患者。诊断标准：根据1999年 WHO诊断标准诊断2型糖尿病；依据中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南2013年版糖尿病周围神经病变诊断及排除标准诊断糖尿病周围神经病变。根据上述标准将入选的208例T2DM患者分为无糖尿病周围神经病变组(DPN0)125例，其中男性63例，女性62例，平均年龄(56.38±14.91)岁,糖尿病周围神经病变组(DPN)83例，其中男性37例，女性46例，平均年龄(60.82±15.11)岁。以体检血糖、血脂、血生化指标正常，无糖尿病、高血压病家族史的101例作为健康对照组(NC组)，其中男性56例，女性45例，平均年龄(47.5±8.21)岁，彼此间无亲缘关系。

1.2 方法 模板DNA用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取。PCR-RFLP方法检测基因多态性。北京市理化分析测试中心合成引物，上游引物5'-GAGAC-GCCTTGA AGTAACTG-3'，下游引物5'-AACCAAAGATG TTCTGAA CTGA-3'。PCR反应体系：50 μL反应体系中引物浓度为30 μmol/L，56 μmol/L的dNTP浓度，加入5 U的Taq酶，94℃预变性5 min，然后94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30个循环，终末72℃延伸5 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳证实后，在20 μL酶切体系中加4 μL产物用5 U的酶消化9 h，在紫外检测系统中观察结果(见图1)。PCR扩增的目的片段长度为180 bp，CC基因型只有180 bp一条片段，CG基因型有180 bp、120 bp、60 bp三条片段，GG基因型有120 bp和60 bp两条片段(60 bp片段看不到)。并测序确定CC基因型和GG基因型(见图2)。

图1 酶解后琼脂糖凝胶电泳图注：M为DNA分子量标记；1、4为GG基因型，2、8为CG基因型，3、5、6、7为CC基因型。

图2 GG、CC基因型的测序图谱注：箭头所指为多态性位点，三角形所指为酶切位点。

1.3 观察指标 体质量指数(body mass index，BMI)，收缩压(systolic blood pressure，SBP)，舒张压(diastolic blood pressure，DBP)，空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)，餐后2 h血糖(two hour postprandial plasma glucose，2 hPG)，糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.4 检测方法 应用全自动生化分析仪检测血糖和血脂变化，用亲和层析法测HbA1c。应用全自动生化分析仪检测血糖和血脂变化，采用终点法进行检测，终点法(Endessay)完全被转化成产物，不再进行反应达到终点，取反应终点的吸光度来计算血糖和血脂的浓度。生化检验中除酶和BUN、CRE外几乎都用终点法来进行检测。(1)一点终点法：取反应达终点时的一个点的吸光度来计算结果；(2)二点终点法：取反应尚未开始时读取一个点的吸光度，待反应达终点时再取第二点的吸光度。用第二点吸光度减去第一点吸光度的差值来计算结果。主要用于扣除试剂和样品空白。保证结果的准确性。一般双试剂用。利用亲和层析法测HbA1c，将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件，将被结合的蛋白质洗脱下来，利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子。

1.5 统计学方法 应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DPN0组和DPN组患者的生化指标和临床资料比较 两组患者在临床资料及各种生化指标方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 DPN0组和DPN组患者的临床资料比较(±s)

表1 DPN0组和DPN组患者的临床资料比较(±s)

注：1 mmHg=0.133kPa。

指标DPN0组DPN组t值P值63/62 56.38±14.91 5.58±4.99 23.45±3.53 142.38±20.82 8.92±3.24 81.84±12.77 14.68±5.51 9.65±2.74 4.99±1.63 2.36±2.49 2.67±0.99 1.08±0.38性别(男/女，例)年龄(岁)病程(年) BMI(kg/m2) SBP(mmHg) FPG(mmol/L) DBP(mmHg) 2 hPG(mmo1/L) HbA1c(%) CHOL(mg/mL) TG(mmo1/L) LDL-C(mmo1/L) HDL-C(mmo1/L) 37/46 60.82±15.11 6.15±5.08 23.54±4.06 141.57±22.14 8.76±3.38 81.7±12.66 14.7±5.2 9.79±2.97 5.12±2.09 2.29±3.01 2.42±0.94 0.99±0.3 0.12 0.45 0.56 0.12 0.45 0.72 0.95 0.43 0.85 0.43 0.96 0.12 0.19＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

2.2 各组间基因型频率和等位基因频率比较 DPN0组的GG基因型频率明显高于NC组(χ2= 8.699，P=0.013；χ2=7.941，P=0.019)，DPN组和NC组的GG基因型频率差异无统计学意义(χ2=0.766，P= 0.381)。DPN0组、DPN组的G等位基因频率都明显高于NC组(χ2=7.519，P=0.006；χ2=5.426，P=0.02；χ2=8.404，P=0.004)，但DPN0和DPN两组间G等位基因频率差异无统计学意义(χ2=0.033，P=0.855)，见表2。

表2 各组IL-6基因频率和等位基因[例(%)]

3 讨论

DPN是糖尿病最常见的慢性并发症之一，对患者生活质量影响颇大。随着人口老龄化的加重，糖尿病神经病变的发病率逐步升高，糖尿病神经病变的发病率也急剧升高[3]。国外研究报道DPN发病率随年龄和病程增加，T2DM病程到达25年后周围神经病变的发生率可达50%以上[4]。国内外报道糖尿病周围神经病变发病率的不同，与其诊断标准有相应关系[5]，肌电图是糖尿病周围神经病变诊断的“金标准”，但其仅反映有髓鞘的大神经纤维的功能状态，而神经末梢和小纤维改变常是糖尿病周围神经病变的早期改变，因此单独使用金标准时，常可遗漏部分患者。

糖尿病周围神经病变病理改变主要表现为周围神经的脱髓鞘和或轴索变性。发病机制涉及多个方面：缺血缺氧、糖基化终产物的增多和氧自由基过多等。张媚等[6]研究发现用糖基化终产物对雪旺细胞体外干预，其干预组雪旺细胞增殖迁移能力减弱，凋亡增加，并且该组中TNF-α、IL-6水平明显高于空白对照组及牛血清清蛋白组，初步提示雪旺细胞的损害可能通过促炎症细胞的表达来实现。焦洋等[7]发现炎症因子与糖尿病周围神经病变的发生有关，其通过抑制IL-6等炎症因子的表达从而实现对糖尿病周围神经病变的保护。糖尿病痛性神经病变的发生与促炎性细胞因子有关，对糖尿病周围神经病变进展性的患者进行腓肠神经活检，与炎症反应相关的大多数基因表达均上调[8]。因此，炎症和氧化应激的病理生理变化在糖尿病周围神经病变的发生发展中起重要作用。糖尿病发生时，血糖升高，导致氧化应激增强，NF-кB活性增强，ROS增多，从而产生一系列促炎症反应，引起炎症反应放大的恶性循环。

Kitamura等[9]发现体外培养单核细胞，IL-6基因型及等位基因不同，IL-6含量及分泌能力也有所差异，其中GG基因型、G等位基因携带者在体外培养的单核细胞IL-6含量及分泌能力均明显增加。国内学者对于IL-6在糖尿病周围神经病变发生发展中的作用的研究结果都存在差异，不同药物治疗前后IL-6的变化也存在差异。张丽等[10]研究发现，IL-6在DM和DPN组较健康对照组均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，IL-6在DM组和DPN组间的差异无统计学意义(P＞0.05)，阮园等[11]的研究与张丽等[10]相似。宋庆芳等[12]研究提示：IL-6是导致糖尿病周围神经病变发生的危险因素，而在糖尿病周围神经病变治疗中，采用度洛西汀和甲钴胺联合治疗糖尿病痛性神经病变，治疗后，测定IL-6水平明显低于治疗前[13]，而前列腺素E1治疗前后差异无统计学意义[10]。

本研究显示：DPN0组和DM组的G/G基因型频率均明显高于NC组，而DPN组和NC组的G/G基因型频率差异无统计学意义，这表明IL-6基因启动子区-634G/G基因型与糖尿病的发生有关，与糖尿病周围神经病变的发生无明显联系。DPN0组、DPN组及DM组的G等位基因频率均明显高于NC组，但DPN0和DPN两组间G等位基因频率差异无统计学意义，这表明G等位基因与糖尿病及糖尿病周围神经病变的发生均有关系，但在糖尿病进展为糖尿病周围神经病变的过程中作用不大。IL-6及基因多态性对糖尿病周围神经病变影响的精确机理并不十分清楚，尚待深入探讨。

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Correlation between 634C/G polymorphism of IL-6 gene and diabetic peripheral neuropathy.

AN Xin-huan1, DING Jun-cai2,WU Yan-feng3,LIANG Gan-xiong1.1.Department of Endocrinology,the People s Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;2.Department of Pediatrics,the People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;3.The Physical and Chemical Analysis and Testing Center of Beijing City,Beijing 100094,CHINA

Objective To investigate the association of IL-6 gene promoter region-643C/G polymorphism with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was applied to detect the polymorphism of IL-6 gene promoter region-634 C/G in 125 cases of type 2 diabetes mellitus without DPN(DPN0 group)and 83 cases of type 2 diabetes mellitus with DPN(DPN group),which were treated in our hospital from Jan.2014 to Jan.2015,as well as 101 normal controls(NC group).The relative clinical data, genotype frequency and allele frequency were compared between groups.Results The GG genotype frequency was significantly higher in DPN0 group than NC group(16.0%vs 4.0%,P＜0.05).The G allele frequency was significantly higher in DPN0 group(34.4%)and DPN group(33.1%)than NC group(22.3%),P＜0.05,with no statistically significant difference between DPN0 group and DPN group(P＞0.05).Conclusion The IL-6 promoter region-643G/G genotype is not a genetic risk factor of DPN development,and IL-6-634G allele may be one of the risk factors in DPN development.

IL-6;Gene;Promoter region;Polymorphism;Diabetic peripheral neuropathy(DPN)

R587.2

A

1003—6350（2016）15—2435—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.008

2016-03-15)

广东省中山市科技局基金资助项目（编号：2006A035）

安新焕。E-mail：axh1998@sina.com