LXR mRNA在动脉粥样硬化兔中的表达变化

2016-03-13 05:59刘炜枫赵帅陈伯钧张烈元蔡海荣唐咏曾靖
海南医学 2016年15期
关键词:电镜兔子胆固醇

刘炜枫,赵帅,陈伯钧,张烈元,蔡海荣,唐咏,曾靖

(1.广东省中西医结合医院重症医学科,广东 佛山 528200;2.广州中医药大学第二临床医学院,广东 广州 510405)

LXR mRNA在动脉粥样硬化兔中的表达变化

刘炜枫1,赵帅2,陈伯钧2,张烈元2,蔡海荣2,唐咏2,曾靖2

(1.广东省中西医结合医院重症医学科,广东 佛山 528200;2.广州中医药大学第二临床医学院,广东 广州 510405)

目的 观察LXR mRNA在动脉粥样硬化(AS)兔不同时段的表达,探讨LXR对AS的影响。方法 采用随机对照研究的方法将20只健康雄性新西兰兔分为对照组和AS组,各10只,对照组予普通饲养,AS组予高脂饲养并注射牛血清白蛋白。分别在第1周和第8周检测两组兔子胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、LXR mRNA及髂外动脉组织电镜检测。结果 血脂方面,第1周,AS组TC升高,HDL-C降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);第8周,AS组TC、LDL-C均升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);髂外动脉内膜形态学方面,AS组第1周和对照组第1、8周肉眼观察0级。第8周AS组肉眼观察0.5级;髂外动脉内膜组织电镜检测方面,AS组第1周和对照组第1、8周未见明显病理改变。AS组第8周可见平滑肌细胞中充满了大量脂滴小泡,胞浆中可见胆固醇结晶样物质、密体和线粒体等结构;LXR mRNA表达方面,第1周,LXRα mRNA组间比较差异无统计学意义(P>0.05);第8周,AS组LXRα mRNA升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LXRα mRNA表达升高可能是一种改善动脉粥样硬化早期的代偿调节机制。

LXR mRNA;胆固醇;甘油三酯;动脉粥样硬化;兔子;电镜检测

动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)是一种慢性动脉疾病,具有很高的发病率和死亡率,可引起冠心病和脑卒中等,对人类生命健康构成极大威胁。肝脏、肌肉、小肠以及脂肪组织等部位对糖脂的吸收转运利用和糖皮质激素代谢的调节[1-3],有一部分是通过核受体超家族成员肝X受体(LXRs)与胆固醇结合后,激活下游SREBP1c、GLUT、UCP-1、载脂蛋白等而实现的[4]。本研究通过制备家兔AS模型,检测肝X受体的表达,分析肝X受体与AS早期变化之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选用3个月龄健康雄性新西兰兔(广州花都区花东信华实验动物有限公司提供)20只,体质量(2.5±0.5)kg。采用随机对照研究的方法将兔子分为对照组和动脉粥样硬化组(AS组),各10只。

1.2 动物喂养 在广东省中医药科学院实验动物中心喂养(每笼1只)。(1)饲养条件:室温(22±4)℃,相对湿度(58±6)%,白天与黑夜环境由光线模拟生成,循环时间为12 h。适应性饲养10 d。之后对照组普通饮食,AS组高脂饮食。饲料真空包装,由广东省医学实验动物中心提供。(2)普通饲料配方:碳水化合物68%、蛋白22%、食盐0.5%、脂肪10%。(3)高脂饲料配方:84%基础饲料、10%蛋黄粉、4%猪油和2%胆固醇。

1.3 动脉粥样硬化动物造模 采用免疫性内皮损伤合并高脂饲料诱导,造模第1天对照组一次性耳缘静脉注射250 mg/kg的生理盐水,AS组一次性耳缘静脉注射牛血清白蛋白250 mg/kg。各组动物每日进食总量相等,每日100 g,分两次,每12 h一次。观察8周,每周测体质量1次。

1.4 观察指标和方法

1.4.1 生化指标 兔子禁食12 h后,经耳缘静脉抽血,在冰箱静置,时间0.5 h,温度:4℃。之后离心,转速:3 000 r/min。通过生化分析仪(罗氏Co-bas8000)测定血脂四项(TC、TG、LDL-C、HDL-C)。

1.4.2 形态学观察 实验结束后解剖,对髂外动脉壁病变进行肉眼观察分级[5]。总共有6级。内膜比较光滑代表0级;内膜有广泛奶油样变化代表0.5级;内膜有明显的凸起但面积小于3 mm2的奶油样斑块代表1级;如果斑块面积超过3 mm2代表2级;如果大部分斑块面积超过3 mm2代表3级;如果斑块基本覆盖动脉内膜代表4级。

1.4.3 组织电镜检测 在1、8周末,超声检查后,经耳缘静脉注射空气处死兔子,取2 cm左髂外动脉,戊二醛磷酸缓冲液固定,时间不超过3 d,经磷酸缓冲液冲洗,用1%锇酸加0.8%Fe(CN)6固定30 min,再经磷酸缓冲液冲洗,丙酮行梯度脱水,用Epon812包埋,在60℃聚合24 h。首先,用光镜观察制成半薄切片的血管内膜。然后在有支持膜的铜网上放置70~80 nm的超薄切片,先后用5%的水性醋酸铀和枸橼酸染色染色,时间分别为10 min和5 min,最后用透射电镜观察及拍照。电镜型号:JEM-2000EX型。

1.4.4 LXRmRNA检测 通过实时荧光定量PCR的方法检测。采用Trizol一步法提取总RNA,反转录成cDNA(反转录酶:SSⅢ,Invitrogen公司),引物设计如下。反应条件:95℃10 s,60℃30 s,70℃30 s,共40个循环,Ct值取循环阈值均值。△Ct=每组目的基因表达均值-内参均值。LXR-β引物,上游5'-ACAGCCAGACGCTACAACCA-3',下游5'-GGCA ATGAGCAAGGCATACTC-3';LXR-α引物,5'-GGAA CGAGCTATGCAGTGTATGTG-3',下游5'-CCACCGCTATGGCAAATGT-3'。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,符合正态分布、方差齐的数据组间比较采用t检验,不符合正态分布或方差不齐者组间比较采用非参数检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠体质量比较 1周末[(264.60±0.05)g vs(255.80±0.23)g,t=-0.838]和8周末[(329.20±0.51)g vs(328.60±0.18)g,t=-0.025]两组兔子体质量组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组大鼠代谢性指标比较 第1周,两组兔子的TC、HDL-C组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),AS组较对照组升高,见表1;第8周,两组大鼠的TC、LDL-C组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),AS组较对照组升高,见表2。

表1 第1周两组兔子代谢性指标比较(mmol/L,±s)

表1 第1周两组兔子代谢性指标比较(mmol/L,±s)

组别TC TG HDL-C LDL-C AS组(n=5)对照组(n=5) t值P值1.66±0.56 0.44±0.20 -4.559 0.002 0.35±0.22 0.51±0.32 0.912 0.388 0.43±0.14 0.08±0.14 -3.946 0.004 0.93±0.55 1.09±0.13 0.656 0.544

表2 第8周两组兔子代谢性指标比较(mmol/L,±s)

表2 第8周两组兔子代谢性指标比较(mmol/L,±s)

组别TC TG HDL-C LDL-C AS组(n=5)对照组(n=5) t值P值11.84±2.17 1.33±0.18 -10.794 0.000 3.74±4.92 0.70±0.20 -1.379 0.240 0.50±0.48 0.36±0.28 -5.550 0.597 11.39±3.49 0.71±0.36 -6.812 0.002

2.3 两组兔子形态学比较 AS组第1周和对照组第1、8周髂外动脉肉眼观察0级。第8周AS组髂外动脉肉眼观察0.5级。

2.4 两组兔子组织电镜检测结果比较 1周后,对照组可见一平滑肌细胞,细胞核呈长条形,胞浆中可见密体和线粒体等结构,未见明显病理改变。AS组可见平滑肌细胞,细胞核外形不规则,核中常染色质较多,异染色质较少聚集在核内膜下,细胞浆中可见密体等结构,细胞之间联系紧密,见图1。8周后,对照组可见横切的平滑肌细胞,细胞核呈椭圆形,胞浆中可见密体和线粒体等结构,未见明显病理改变。AS组可见平滑肌细胞中充满了大量脂滴小泡,胞浆中可见胆固醇结晶样物质,胞浆中可见密体和线粒体等结构,细胞核不规则,表面有切迹,核中常染色质较多,异染色质较少,见图2。

2.5 两组兔子LXRα和LXRβ mRNA的表达比较 第1周,LXRα和LXRβ mRNA表达组间差异无统计学意义(P>0.05),见表3;第8周,LXRα mRNA表达组间差异有统计学意义(P<0.05),LXRβ mRNA表达组间差异无统计学意义(P>0.05),AS组LXRα mRNA表达较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

图1 1周内皮电镜检测

图2 8周内皮电镜检测

表3 第1周两组LXRα和LXRβ mRNA的表达比较

表4 第8周两组LXRα和LXRβ mRNA的表达比较

3 讨论

动脉粥样硬化是心脑血管疾病早期的重要病理改变。既往研究发现LXR在胆固醇、脂肪代谢以及抗动脉粥样硬化中有重要的作用,是研究的重要靶点。国内研究提示:采用本次实验造模方法可成功培养出兔动脉粥样硬化模型。刘俊等[6]在对家兔注射250 mg/kg牛血清白蛋白后配合4周的高脂饮食,可培养出动脉粥样硬化模型。傅晓东等[7]则在兔去势后的1周、5周、9周,静脉注射250 mg/kg小牛血清白蛋白,在3个月后培养出兔绝经后动脉粥样硬化模型。本次实验在造模第8周可见实验组TC、LDL-C明显升高;髂外动脉肉眼观察0.5级;髂外动脉电镜观察可见平滑肌细胞中充满了大量脂滴小泡,胞浆中可见胆固醇结晶样物质。参照模型标准,本实验动脉粥样硬化的造模方法是可行的。

通过分析动脉粥样硬化兔各指标不同时段的结果,本研究发现:在实验开始阶段,体质量组间差异无统计学意义。随着实验进程,各组动物体质量随时间变化呈上升趋势,但在饲养第8周时,体质量组间差异不显著,说明体质量不影响观察指标的组间比较。而在LXR mRNA的表达方面发现,第8周结果显示LXRα mRNA在AS组兔子中表达升高。而胆固醇在LXRs的作用下可逆向转运[8]。LXRs激动剂抗动脉粥样硬化是通过加强胆固醇的逆向转运和降低血管壁巨噬细胞的炎症反应而实现的[9-11]。因此LXRα表达升高可能是一种改善动脉粥样硬化早期的代偿调节机理。随着后期进一步发展,LXRα的变化机制值得进一步深入研究。

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[6]刘俊,石兴明,程大军,等.川芎总苯酞对家兔动脉粥样硬化的影响[J].中国药物应用和监测,2002,17(5):10-11.

[7]傅晓东,何春燕,陈伟华,等.补肾法对去势兔动脉粥样硬化血清性激素水平及主动脉血管壁雌激素-β受体表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2005,3(1):31-33.

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Expression changes of LXR mRNA in atherosclerosis rabbits.

LIU Wei-feng1,ZHAO Shuai2,CHEN Bo-jun2, ZHANG Lie-yuan2,CAI Hai-rong2,TANG Yong2,ZENG Jing2.1.Intensive Care Unit,Guangdong Province Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine,Foshan 528200,Guangdong,CHINA;2.The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA

Objective To observe the expression of LXR mRNA in different stage of the atherosclerosis rabbits,and investigate the effect of LXR on atherosclerosis.Methods Using randomized controlled method,20 healthy New Zealand male rabbits were equally allocated into control group and atherosclerosis(AS)group.The control group rabbits were fed with common diet,and the AS group rabbits were fed with a high fat diet and injected with bovine serum albumin.Cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein(LDL-C),high density lipoprotein(HDL-C), LXR mRNA and electron microscopic observation of external iliac artery in the two groups at the first and the 8thweek were detected.Results For blood lipid:At the first week,the TC significantly increased(P<0.05)and HDL-C significantly reduced(P<0.05)in AS group;At the 8thweek,the TC and LDL-C significantly increased(P<0.05)in AS group. In morphology of external iliac artery intima,macroscopic observation at the first week of both groups and the 8thweek of the control group were level 0,but level 0.5 at the 8thweek in AS group.In electron microscope inspection,there were no obvious pathological changes at the first week of both groups and the 8thweek in the control group.At the 8thweek,a large amount of fat drops of vesicles,cholesterol crystal sample material,and dense body and mitochondria structure, etc.were visible in the smooth muscle cells in AS group.For LXR mRNA:At the first week,there was no difference between two groups in the expression of LXRα mRNA(P>0.05),while at the 8thweek,the expression of LXRα mRNA in the AS group significantly increased(P<0.05).Conclusion Increased expression of LXRα mRNA may be a compensatory adjustment mechanism to improveAS in the early stage.

LXR mRNA;Cholesterol;Triglyceride;Atherosclerosis;Rabbits;Electron microscopy

R-332

A

1003—6350(2016)15—2413—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.002

2016-03-01)

国家自然科学基金委员会资助青年基金项目(编号:81303117)

曾靖。E-mail:13650978694@193.com

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