胺碘酮对左室肥厚家兔跨室壁Cx43异质性的影响

林小亮，陆士娟，吴淼，孙定军，林德洪，黄康，张伟，钟江华

（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院心血管内科，海南 海口 570208；2.海口市第四人民医院内科，海南 海口 570208）

胺碘酮对左室肥厚家兔跨室壁Cx43异质性的影响

林小亮1，2，陆士娟1，吴淼1，孙定军1，林德洪1，黄康1，张伟1，钟江华1

（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院心血管内科，海南 海口 570208；2.海口市第四人民医院内科，海南 海口 570208）

目的 观察胺碘酮片剂对左室肥厚(LVH)家兔三层心肌间Cx43表达的差异，探讨LVH恶性室性心律失常(MVA)的机制及处理措施。方法 将20只家兔按随机数字法分成胺碘酮治疗组和LVH对照组，每组各10只。两组家兔均采用传统的腹主动脉缩窄术后继续喂养8周以制备LVH模型。治疗组手术后给予经口喂服盐酸胺碘酮片，每日50 mg/kg，连续4周，然后继续喂养4周并进行实验；对照组喂养生理盐水8周后进行实验。分别检测两组家兔心外膜下、中层心肌和心内膜下心肌细胞的单相动作电位复极90%时程(APD90)、跨室壁复极离散度(TDR)以及左心室三层心肌Cx43蛋白表达的差异。结果(1)治疗组家兔心内、外膜下、中层心肌的APD90分别为(275.30±11.42)ms、(251.50±10.98)ms和(295.40±12.41)ms，均较LVH对照组的(236.30±16.51)ms、(217.69±14.25)ms和(265.12±20.01)ms显著延长，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，但是治疗组的TDR为(38.96±10.91)，明显小于对照组的(48.56±11.23)，差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)治疗组家兔三层心肌的Cx43蛋白表达分别为(0.60±0.07)、(0.48±0.05)和(0.57±0.06)，均较对照组的(0.53±0.04)、(0.31±0.06)和(0.48±0.04)明显提高(P＜0.05)，但以中层心肌的增加更为明显，从而缩小了三层心肌间Cx43蛋白表达的差异，△Cx43减少[(0.14±0.06)vs(0.23±0.08)，P＜0.01]。结论 胺碘酮能改善左室肥厚的跨室壁Cx43表达异质性，缩小左心室心肌跨室壁复极不均一性，这可能是其减少MVA发作的生理机制。

中层心肌；缝隙连接蛋白43；左室肥厚；胺碘酮

高血压患者后期往往伴发左心室肥厚(LVH)，而LVH已被证实容易发生恶性室性心律失常(MVA)而致心源性猝死(SCD)，其处理主要以药物治疗为主。而抗心律失常药物在抑制MVA的同时又有致MVA的作用，因此评估和探讨抗心律失常药物的致MVA作用及机制有重要的临床意义。

胺碘酮是临床常用的Ⅲ类抗心律失常药，广泛应用于许多器质性心脏病恶性室性心律失常(MVA)的治疗。近年来的研究进一步表明，胺碘酮与其他抗心律失常药物如普罗哌酮、英卡胺等不同，在抑制MVA的同时并无明显的致MVA作用，这可能与其未增加左心室心肌的跨室壁复极不均一性有关[1-2]。我们的研究主要观察胺碘酮对高血压LVH三层心肌间动作电位和Cx43蛋白表达的影响，探讨胺碘酮治疗LVH MVA的机制，为器质性心脏病MVA的处理提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 将20只体质量2.0～3.0 kg的新西兰大白兔(雌雄不限)按随机数字法分为对照组和治疗组，每组10只。所有家兔均采用传统的腹主动脉结扎术后继续喂养8周以制作LVH模型。对照组手术后经口连续喂服生理盐水8周，而治疗组手术后则喂服盐酸胺碘酮片，每天50 mg/kg，连续4周，停药继续喂养4周后进行实验。

1.2 试剂 配制成分：氯化钠(NaCl)115 mmol/L，氯化钾(KCl)5.4 mmol/L，氯化镁(MgCl2)1 mmol/L，氯化钙(CaCl2)1.8 mmol/L，磷酸二氢钠(NaH2PO4) 1 mmol/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L的正常台式液，并以NaOH调整其pH值至7.4。

1.3 心脏电生理实验 快速切取家兔模型的心脏，并在4℃台式液的条件下停搏。主动脉插管后进行Langendorff恒温恒压灌注。自制三层心肌简易电极，通过医用注射器针头分别固定在心内膜下心肌、心外膜下心肌和中层心肌组织间。破坏心脏窦房结后以1 000 ms固定起搏右心室。正常台式液稳定灌流20 min后记录三层心肌组织的单相动作电位(MAP)。以MAP 0期至复极到振幅90%的水平距离作为APD时程(APD90)，以左心室壁内三层心肌间最长与最短的APD90差值为跨室壁复极离散度(TDR)。

1.4 实验后处理 称量心脏湿重，测量左心室壁厚度，并行左心室心肌组织病理切片。

1.5 提取蛋白质 剪取左心室游离壁并通过快速冰冻切片方法[3]提取三层心肌组织：分别在心内膜下(Endo)、心外膜下(Epi)和中层心肌(Mid)处连续切片10次，每片20 μm(共200 μm)。将切取的三层心肌组织保存在Eppendorf管内，匀浆后以12 000 r/min，4℃离心30 min，取上清液并检测蛋白浓度。

1.6 Cx43蛋白表达检测 采用Western blot方法检测三层心肌间Cx43蛋白表达。提取足量蛋白质后根据样品浓度上样，进行SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳后转PVDF膜，将PVDF膜放入5%TBST脱脂牛奶中在室温下封闭2 h，滴加Cx43单克隆抗体后置于4℃冰箱内过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗并继续在室温下孵育2 h，采用增强化学发光的方法将PVDF膜显色后显影于X线胶片上。用凝胶图像分析系统获取蛋白质信号条带图像后测定目的蛋白Cx43和内参GAPDH的光密度值，计算两者的比值作为Cx43蛋白的表达水平。计算三层心肌间最大与最小的Cx43蛋白差值为跨室壁Cx43表达差异(ΔCx43)

1.7 统计学方法 本实验为完全随机设计资料，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，并使用统计软件SPSS13.0进行统计分析。各组数据均分别行正态性检验或Levene's test方差齐性检验，采用独立样本t检验对两个样本均数进行对比，多个样本均数之间的比较则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以α=0.05(双侧)为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间基础改变比较 两组间家兔的心重/体质量指数、左心室重量和左室壁厚度，病理切片结果均符合LVH的表现，见表1。

表1 胺碘酮对LVH家兔基础变化的影响(±s)

表1 胺碘酮对LVH家兔基础变化的影响(±s)

组别 心重(g)体质量(kg)心重/体质量(g/kg)左室游离壁厚度(mm)治疗组(n=10)对照组(n=10)检验值P值6.39±0.34 6.41±0.31 1.368＞0.05 1.73±0.12 1.71±0.09 1.822＞0.05 3.70±0.27 3.74±0.20 1.269＞0.05 5.96±0.42 5.86±0.43 1.435＞0.05

2.2 两组间跨室壁复极异质性比较 治疗组三层心肌的APD90均较对照组显著延长(P＜0.01)。但胺碘酮治疗组的TDR显著小于LVH对照组，表明胺碘酮虽然延长了LVH家兔的三层心肌APD90，但却缩小了三层心肌之间的跨室壁复极异质性，见表2。

表2 胺碘酮对LVH家兔电生理参数的影响(ms，±s)

表2 胺碘酮对LVH家兔电生理参数的影响(ms，±s)

组别Endo-APD90Mid-APD90Epi-APD90TDR治疗组(n=10)对照组(n=10)检验值P值275.30±11.42 236.30±16.51 4.813＜0.01 295.40±12.41 265.12±20.01 5.026＜0.01 251.50±10.98 217.69±14.25 4.964＜0.01 38.96±10.91 48.56±11.23 2.803＜0.05

2.3 两组间跨室壁Cx43表达异质性的比较 治疗组三层心肌Cx43蛋白表达均较LVH对照组有显著增加(P均＜0.05)，且ΔCx43缩小(P＜0.01)，表明胺碘酮在改善LVH三层心肌Cx43蛋白表达的同时还能够使Cx43蛋白跨室壁表达异质性下降作用，见表3和图1。

表3 胺碘酮对LVH家兔三层心肌间Cx43表达的影响(±s)

表3 胺碘酮对LVH家兔三层心肌间Cx43表达的影响(±s)

组别治疗组(n=10)对照组(n=10)检验值P值Endo-Cx43 0.60±0.07 0.53±0.04 2.662＜0.05 Mid-Cx43 0.48±0.05 0.31±0.06 4.912＜0.01 Epi-Cx43 0.57±0.06 0.48±0.04 2.904＜0.05 ΔCx43 0.14±0.06 0.23±0.08 3.428＜0.01

图1 胺碘酮对LVH跨室壁Cx43表达的影响

3 讨论

近年来的临床数据表明，高血压合并LVH的患者容易发生恶性室性心律失常(MVA)，这是高血压LVH猝死的重要原因[4]。而LVH发生MVA的病理生理基础并不完全清楚，可能与LVH的心肌间血管分布失衡导致心肌缺氧，且心肌间存在明显炎症和纤维化，心肌细胞和组织间质发生改变，心脏自主神经功能的稳定性降低等相关。以上这些因素都会增加左心室心肌的电活动不稳定，从而容易诱发MVA致SCD[5]。LVH心电的不稳定是多种形式的，有研究显示：LVH时左心室三层心肌APD明显延长，但中层心肌APD的延长更为明显，TDR增大，跨室壁复极不均一性增加，早后除极的异位心电容易在三层心肌间折返而诱发MVA[6]。APD的延长可能与心室肌细胞上延迟整流钾电流(Ik)的减弱有关，而心室肌横断面上不同部位的Ik慢电流成分Iks的差异却是左心室三层心肌间复极时程不均一性增加，容易诱发折返性室性心律失常的基础[7]。

胺碘酮是临床常用的抗室性心律失常药物，主要通过阻断心肌细胞上的钾离子通道，延长动作电位时程而发挥作用。但其又有别于其他的Ⅲ类抗心律失常药，还具有抗纤颤及抗交感神经等多种电生理效应。近年来的研究表明，胺碘酮与其他抗心律失常药物索他洛尔、普罗哌酮、英卡胺等不同，在抑制MVA的同时并无明显的致MVA作用，这可能是因为它同时抑制延迟整流钾电流的快、慢成分(Ikr、Iks)[8]，缩小三层心肌间Iks的差异，减小跨室壁复极的不均一性，因此其致MVA的作用较小。本实验结果也表明，胺碘酮治疗组左心室心内外膜下心肌和中层心肌的APD90均较LVH对照组显著增大，但是TDR却明显小于LVH对照组，也显示胺碘酮在延长心肌复极时程的同时，还使三层心肌之间的复极异质性缩小，有改善复极离散的作用。

心肌组织Cx43蛋白是心电活动的分子基础，MVA的发生与Cx43蛋白的重构密切相关，而且Cx43在心肌细胞分布的数量与空间上也存在差异，这种差异是器质性心脏病跨室壁复极异质性增加的基础[9]。本实验中我们的蛋白质分析结果进一步显示，与LVH对照组比较胺碘酮治疗组心内外膜下心肌、中层心肌的Cx43蛋白表达均明显增加，且中层心肌的增加更为显著，从而缩小了三层心肌间Cx43表达的差异，ΔCx43进一步缩小，这可能是胺碘酮改善LVH跨室壁复极不均一性的蛋白分子机制。

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Effects of amiodarone on transmural heterogeneous of Cx43 in rabbits with left ventricular hypertrophy.

LIN Xiao-liang1,2,LU Shi-juan1,WU Miao1,SUN Jing-jun1,LIN De-hong1,HUANG Kang1,ZHANG Wei1,ZHONG Jiang-hua1.1.Department of Cardiology,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.Department of Internal Medicine,the Fourth People's Hospital of Haikou, Haikou 570208,Hainan,CHINA

Objective To observe the effects of feeding amiodarone on heterogeneity of Cx43 expression in the rabbit model with left ventricular hypertrophy(LVH),and investigate the mechanisms of amiodarone on malignant ventricular arrhythmias(MVA)induced by LVH.Methods Twenty rabbits were randomly divided into LVH group (n=10)and amiodarone group(n=10).LVH model was produced with traditional abdominal aortic coarctation in the both group.Rabbits in the LVH group were continuing to feed for 8 weeks after surgery,and given feeding amiodarone tablets[50 mg/(kg·d)]for four consecutive weeks after surgery in the amiodarone group.90%monophasic action potential repolarization duration(APD90)of subepicardial,midmyocardial and subendocardial myocardium,transmural dispersion of repolarization(TDR)and Cx43 protein expression in three layers of myocardium were measured in both groups.Results(1)APD90 of endomyocardial,epimyocardial and midmyocardiallayers in the amiodarone group were(275.30±11.42)ms,(251.50±10.98)ms and(295.40±12.41)ms respectively,which significantly prolonged than those in the LVH group of(236.30±16.51)ms,(217.69±14.25)ms and(265.12±20.01)ms(P＜0.01).However,TDR were significantly decreased in the amiodarone group[(38.96±10.91)vs(48.56±11.23),P＜0.05].(2)Three myocardial Cx43 protein expression in the amiodarone group were(0.60±0.07),(0.48±0.05)and(0.57±0.06)respectively,which significantly increased compared to those in the LVH group[(0.53±0.04),(0.31±0.06)and(0.48±0.04)],P＜0.05.Increasing of midmyocardial Cx43 was more significant,so difference of Cx43 among three myocardium reduced and△Cx43 decreased[(0.14±0.06)vs(0.23±0.08),P＜0.01].Conclusion Amiodarone can reduce MVA in LVH by decreasing ransmural heterogeneity of Cx43 protein expression and improving transmural dispersion of repolarization.

Midmyocardium;Cx43;Left ventricular hypertrophy(LVH);Amidarone

R-332

A

1003—6350（2016）15—2416—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.003

2016-05-27)

海南省卫生厅基金项目(编号：琼卫2013资助-011)；海口市人民医院院内项目(编号：2013-YQL-13)

钟江华。E-mail：435833825@qq.com