姜黄素联合紫杉醇对肺癌细胞PC9凋亡的影响

王荣俊，童斯浩

·基础医学·

姜黄素联合紫杉醇对肺癌细胞PC9凋亡的影响

王荣俊1，童斯浩2

目的：研究姜黄素联合紫杉醇对人肺癌细胞PC9凋亡的影响。方法：将不同浓度梯度姜黄素和紫杉醇单用(单药组)和联合(联合组)作用于PC9细胞，MTT法测定其对PC9的增殖抑制作用，流式细胞术检测单药和双药联合对细胞周期分布和凋亡的影响，Western blot法检测凋亡相关蛋白表达的变化。结果：两药均以时间和剂量依赖方式抑制PC9细胞的增殖，联合组抑制作用大于单药组(P<0.01)。两药均能诱导PC9细胞发生凋亡和G0/G1期阻滞，联合组细胞凋亡和G0/G1期阻滞作用显著增强(P<0.01)。Western blot法检测显示，联合组Caspase-3蛋白、Bcl-2、Bax的改变显著大于单药组(P<0.01)。结论：姜黄素、紫杉醇可抑制人肺癌PC9细胞增殖，诱导其凋亡，阻滞细胞G0/G1期，伴随Caspase-3活性上调，且两者联合应用可显著促进细胞凋亡。

肺肿瘤；姜黄素；紫杉醇；凋亡

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，随着工业化进程加快及全球环境恶化，在我国已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，寻找低毒高效的治疗手段是肺癌面临的巨大挑战[1-2]。姜黄素(CUR)是从中药姜黄中提取的一种有效化学成分，具有多种抗肿瘤活性机制，且不良反应少[3]。紫杉醇(PA)是抗微管微丝类化疗药，是多种恶性肿瘤化疗的一线药物。本研究以人肺癌细胞PC9为研究对象，通过研究CUR联合PA对PC9细胞的促凋亡作用，为肺癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 流式细胞仪、酶标仪、垂直电泳槽、湿式转膜仪购于美国BIO-RAD公司；离心机购自于德国Eppendorf公司；CO2培养箱购于中国贝博公司。实验用药物购自中国贝博公司；实验用细胞株购自中科院上海细胞库。高糖DMEM培养基、小牛血清、四甲基偶氮唑蓝、实验用抗体购于中国贝博公司及美国Cell Single公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖抑制实验 取实验用细胞消化、离心后接种至96孔板中，设3个复孔。设CUR 20 μmol/L(CVR组)、PA 0.1 μmol/L(PA组)和CUR 20 μmol/L+PA 0.1 μmol/L(CVR+PA组) 3个梯度。对照组不加药。分别培养24、48、72 h后，加入MTT，以酶标仪在490 nm双波长检测相应的吸光度，实验重复6次。

1.2.2 细胞周期及凋亡的变化 取实验用细胞悬液种于6孔板中。CVR组、PA组、CUR+PA组加药后培养24 h，消化、离心细胞后4 ℃ 70%无水乙醇固定过夜，次日，PBS洗涤离心细胞后加入400 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI) 染液，以流式细胞仪检测细胞周期变化，实验重复6次。同样取细胞按上述药物浓度培养24 h后洗涤,收集细胞入流式管中，标记抗体后，采用流式细胞仪检测其凋亡。实验重复6次。

1.2.3 Western blot法检测蛋白表达 取对数生长期细胞培养于6孔板中，每孔2 mL，实验设CUR 20 μmol/L、PA 0.1 μmol/L、CUR 20 μmol/L+PA 0.1 μmol/L 3个实验组，加药后培养24 h，胰酶消化、离心，预冷PBS洗涤细胞2遍，弃上清液，收集各组细胞。各组细胞加入蛋白裂解液裂解细胞，以BCA法蛋白定量，每孔30 μg上样，电泳转膜后封闭，先后以小鼠抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax单抗、山羊抗小鼠二抗孵育，ECL显影，暗室曝光成像。

1.3 统计学方法 采用单因素方差分析及校正t检验。

2 结果

2.1 两药对肺癌细胞PC9增殖抑制的影响 MTT结果显示，两药单独作用下，均对肺癌细胞PC9有增殖抑制作用。两药联合时，其增殖抑制效应均较单药更为明显(P<0.01)(见表1)。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡及周期的影响 两药联合联合作用下，细胞周期中G0/G1期细胞群分布50%左右，较单药组明显增加。流式凋亡分析显示，CUR+PA组凋亡率67%左右，均明显高于CUR和PA组(P<0.01)(见图1、表2)。

表1 各组PC9细胞增殖抑制率比较±s)

q检验：与CUR+PA组比较**P<0.01

分组凋亡率/%细胞群/% G0/G1 S G2/M 对照组4.72±0.1328.71±1.3153.47±2.8818.18±0.93CUR组28.43±1.92**△△35.29±2.01**△△57.82±3.10**△△7.10±0.51**△△PA组26.35±2.81**△△37.12±2.83**△△54.78±2。91**△△8.31±0.41**△△CUR+PA组66.54±3.31**48.93±2.12**47.53±2.14**3.67±0.19**F975.9094.2015.23683.60P<0.01<0.01<0.01<0.01MS组内5.6914.5757.7480.333

q检验与对照组比较**P<0.01；与CUR+PA组比较△△P<0.01

2.3 Western blot法检测相关凋亡蛋白表达的影响 两药作用后，活性Caspase-3蛋白表达明显增高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调，各组与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05～P<0.01)，CUR+PA组和单药组相比差异亦均有统计学意义(P<0.01)(见表3)。

3 讨论

肺癌的治疗手段多样，化疗仍是最主要的治疗方式，但总生存时间及无病生存时间仍不尽如人意，因此，寻找低毒高效的新型药物意义重大。

表3 各组蛋白质表达相对灰度值比较

q检验：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01与CUR+PA组比较△△P<0.01

CUR广泛存在于姜科植物中，研究证实，CUR在体外可以协同氟尿嘧啶等对结肠癌等多种细胞株具有协同杀伤效应[4-5]，可以通过抑制NF-κB、cyclinD1、XIAP等，实现抗肿瘤效应[6]，且其抗瘤谱广、不良反应少，在抗肿瘤或化疗增敏中具有良好前景。PA是抗微管药物，其在多种恶性肿瘤治疗中均为一线用药。

细胞凋亡是指在基因调控下产生的主动死亡过程，其中Caspase联级反应是影响细胞凋亡的重要机制[7]。Caspase家族中Caspase-3是否被激活是细胞凋亡的决定性因素。Bcl-2家族蛋白是影响线粒体凋亡途径的重要蛋白群，表达于线粒体膜上及膜内，其家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2 及促凋亡蛋白Bax共同维持着线粒体膜的稳定性，是细胞凋亡的重要指标之一[8]。

本实验结果显示，两药单独及联合作用于肺癌PC9细胞后，均对其具有增殖抑制作用，且联合组高于单药组。流式细胞术显示，两种药物均对细胞株PC9有促凋亡和周期阻滞作用，且联合组高于单药组。另外，Western blot显示，联合组中活性Caspase-3蛋白的上调、Bcl-2下调、Bax表达上调，提示联合组药物抗肿瘤机制可能与激活线粒体凋亡相关，可为CUR的抗肿瘤作用提供理论基础。

综上，本实验结论为CUR的临床抗肿瘤作用提供了更为直接的理论依据。但对于CUR可能涉及到的其他抗肿瘤途径和分子、动物模型的建立，以及临床效应观察尚需进一步研究。

[1] SPIRO SG,TANNER NT,SILVESTRI GA,etal.Lung cancer:progress in diagnosis,staging and therapy[J].Respirology，2010,15 (1):44.

[2] LEONG D,RAI R,NGUYEN B,etal.Advances in adjuvant systemic therapy for non-small-cell lung cancer[J].World J Clin Oncol,2014,5(4):633.

[3] 张君,童钟,李迎霞,等.姜黄素对肿瘤细胞增殖的影响[J].安徽医药,2014,18(8):1545.

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[5] 张长林,孔蕴源,万腊根.姜黄素诱导维甲酸耐药的NB4 R1细胞凋亡及其机制[J].中国实验血液学杂志，2010,18(2):340.

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[7] GÜNTHER C,BUCHEN B,NEURATH MF,etal.Regulation and pathophysiological role of epithelial turnover in the gut[J].Semin Cell Dev Biol，2014,35:40.

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(本文编辑 周洋)

The effect of curcumin combined with paclitaxel on lung cancer cell PC9

WANG Rong-jun1,TONG Si-hao2

(1.MedicalSchootofHefeiTechnicalChollege,ChaohuAnhui238000;2.DepartmentofOncology,TheChaohuAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,ChaohuAnhui238000,China)

Objective:To study the apoptosis-inducing effects of curcumin(CUR) combined with paclitaxel(PA)on lung cancer cell line PC9.Methods:The PC9 cells were treated with different concentrations of single drug or two drugs combination.The anti-proliferative effect of drug was measured using MTT.The effects of single drug and two drugs combination on the cell cycle distribution and apoptosis were measured by flow cytometry.The expressions of apoptosis-related protein were detected by western blotting.Results:Two drugs could inhibit the prolification of PC9 cells with time-and concentration-dependent manner,and the profilication inhibiting rate of curcumin combined with paclitaxel was higher than that of CUR or PA.The apoptosis and G0/G1phase arrest of PC9 cells treated with drug combination significantly enhanced(P<0.01).The protein expression changes of Caspase-3,Bcl-2 and Bax in PC9 cells teated with drug combination were significantly more than that with single drug(P<0.01).Conclusions:The CUR and PA can inhibit the proliferation of human lung cancer cell PC9,induce apoptosis,block cell G0/G1phase and inprove the Caspase-3 activity.Two drugs combination can significnatly promote the PC9 cells apoptosis.

lung neoplasms;curcumin;paclitaxel;apoptosis

2016-03-31

1.合肥职业技术学院 医学分院，安徽 巢湖 238000；2.安徽医科大学附属巢湖医院 肿瘤科，安徽 巢湖 238000

王荣俊(1964-)，男，副教授.

1000-2200(2016)12-1549-03

R 734.2

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.003