基于iTRAQ技术的肝细胞生长因子促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学研究*

匡文斌，邓秋婵，舒少为，何树泉，王强

（广东省深圳市龙华新区中心医院 检验科，广东 深圳 518110）

乳腺癌是临床中较为常见的恶性肿瘤，近年来由于诊断技术的发展及生活方式的改变，该症发病率呈上升趋势，对女性健康及生活质量具有严重影响。由于乳腺癌细胞出现转移及侵袭的相关机制尚未完全清楚，因此对于乳腺癌的临床诊治难度较大。有研究指出，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）作为一种多功能细胞因子，在乳腺癌的生长、转移以及侵袭中起着重要参与作用，乳腺癌细胞的侵袭同HGF表达具有密切关联[1]。本研究为明确HGF对乳腺癌细胞侵袭的诱导作用，基于iTRAQ技术，对HGF促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学进行探讨，现报道如 下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取本院2012年3月-2014年3月收治的乳腺癌患者40例为研究对象，年龄28～56岁，平均（37.5±2.1）岁；TNM分期：15例为Ⅰ期；20例为Ⅱ期；5例为Ⅲ期。纳入标准：符合乳腺癌诊断标准并经病理确诊者；浸润性导管癌；与本研究配合者。排除标准：心脑血管疾病者；精神神经系统疾病者；血液疾病者。

1.2 材料与试剂

iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit和2D Quant Kit（Sigma公司)，胰蛋白酶（Gibco公司）肝细胞生长因子抗体（Santa Cruz公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质提取消化 用层析柱Genway Seppro-TM（Genway Biotech,Inc.）去除高丰度蛋白质，加入三氯乙酸TCA沉淀蛋白，蛋白定量后进行还原烷基化加入丙酮沉淀蛋白，复融后加入胰蛋白酶酶解。

1.3.2 iTRAQ标记、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）分离肽段分为4组（iTRAQ-对照组，iTRAQ-Ⅰ期乳腺癌组，iTRAQ-Ⅱ期乳腺癌组，iTRAQ-Ⅲ期乳腺癌组），每组样品对应一个1个分子质量。加入异丙醇混匀后再加入对应样品液中反应2 h；标记后各组肽段混合，加人缓冲液A，调整pH=3.0，用phenomenex SCX（200 a,4.6mm,250mm）过柱分离。

1.3.3 MS/MS鉴定 样品用Ziptip层析柱脱盐后，反相柱分离，ESI-QTOF-MS分析。用Data Analysis 4.0（Bruker）分析数据。经MASCOT 2.2搜库，Scaffold软件分析，变化倍数2.0 倍以上为显著差异。

1.3.4 Western Blot检验差异蛋白 提取蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳，转膜，封闭，抗体抗体反应，ECL显色，凝胶成像系统显像和数据收集。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血清中总共鉴定出264个蛋白，达到严格定量标准的蛋白有92个；乳腺癌与对照组间共筛选出19个差异表达蛋白；笔者选择HGF作为其中表达差异较大的一个蛋白进行验证。

iTRAQ标记图谱显示乳腺癌组与健康对照组之间血清HGF表达水平具有较大差异，笔者通过Western Blot验证结果证实，3组乳腺癌患者（3组分别为Ⅰ期乳腺癌患者；Ⅱ期乳腺癌患者；Ⅲ期乳腺癌患者）血清中HGF表达水平同健康对照组比较明显较高，差异有统计学意义（P＜0.05），这个与iTRAQ标记图谱鉴定结果一致，见图1。

图1 Western Blot验证差异蛋白

3 讨论

乳腺癌在所有女性恶性肿瘤中占有较高比例，多数患者在确诊后已为中晚期，错过最佳就治疗时机，使得远期存活率难以有效提高。对于乳腺癌发生侵袭以及转移的机制进行研究，对于提高早期诊断率，改善治疗效果，延长患者存活时间具有重要意义。HGF有34 kDa的β链和69 kDa的α链组成，最开始被认为是一种能够对成熟肝细胞产生分裂促进作用的细胞因子。但目前有研究表明，该物质在肿瘤的生长、转移以及侵袭中具有重要参与作用，且能够促进肿瘤的血管形成，在较多恶性肿瘤中，如肝癌、肺癌以及乳腺癌等，均可发现HGF的特异性受体c-Met表达[2]。以HGF作为基因靶点进行肿瘤的治疗及其网络调控机制的研究是近年来的热 点。

但目前关于HGF对于乳腺癌细胞侵袭促进作用的调控网络机制尚未完全明确，需更为深入的研究，本研究通过iTRAQ技术对HGF促进乳腺癌细胞侵袭的具体调控作用进行了系统的研究，阐明了HGF过表达载体转染MDA-MB-231乳腺癌细胞株前后蛋白表达的差异，建立HGF诱导MDAMB-231乳腺癌细胞侵袭的蛋白调控网络。iTRAQ试剂的组成，是通过8种等量异位标签的分子完成，能够同耐氨基酸侧链以及氨基酸末端的胺标记同重元素。iTRAQ多重化学标记串联质谱技术能够鉴定所有种类的蛋白质，具有强大功能，且该技术能够对多种样品进行同时分析，具有高通量。研究发现，iTRAQ试剂可以标记蛋白质水解的肽段，并通过串联质谱方法，进行鉴别、定量[3]。且该技术的使用，可以得到的蛋白数量达到500～600种，并能获得不同样本间蛋白质表达差异。

iTRAQ技术同其他同位素标记技术比较，具有较多优势：①iTRAQ技术所标记的同重元素量对不同样本中的同一个蛋白质是相同的，因此能够比较不同样品中的蛋白质量；②iTRAQ能够对2～8个样本进行同时标记，且标记效率高，过程简单；③在样本中加入iTRAQ试剂标记的已知量的标准蛋白，可以对样本中的蛋白进行绝对定量研究[4-5]。

综上所述，iTRAQ技术能够对机体细胞、组织及体液的不同生理状态进行研究，同时能够对不同状态下的蛋白质组异同进行有效分析。而对同正常生理状态下的特异蛋白质标记物进行寻找与发现，能够对疾病的病理机制进行充分了解，促进疾病的防控与诊治。因此，基于iTRAQ技术的HGF促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学研究，能够为乳腺癌的临床诊治进行有效指导，为靶向治疗药物的开发提供参考。

[1]曹美群,孙珂焕,吴安民,等.应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选乳腺癌患者血清差异表达蛋白[J].基础医学与临床,2014,34(8):1054-1058.

[2]李莉,唐杰,于春霞,等.基于iTRAQ标记结合2D nano HPLCESI-OrbiTrap MS/MS技术筛选卵巢癌血清标记物[J].中国肿瘤临床,2012,39(24):2075-2079.

[3]杨桦,张崇建,王子兵,等.浸润性乳腺癌中肝细胞生长因子的表达及其与化疗敏感性和预后的相关性[J].安徽医科大学学报,2012,47(8):966-969.

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[5]Feng,T.Yi,J.Wei,L.et al.Global Liver Proteome Analysis Using iTRAQ Labeling Quantitative Proteomic Technology to Reveal Biomarkers in Mice Exposed to Perfluorooctane Sulfonate (PFOS) [J].Environmental Science & Technology:ES&T,2012,46(21):12170-12177.