南京地区儿童患者肺炎链球菌的血清型分布

苗丹青，徐飞，李军强，刘婧筠，邵忠琦，朱涛，钟天鹰

（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.江苏省南京市儿童医院 检验科微生物室，江苏 南京210008；3.天津康希诺生物技术有限公司，天津 300457；4.江苏省南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004）

肺炎链球菌是一种重要的人类致病菌，可以引起肺炎、脑膜炎及中耳炎等多种疾病。世界卫生组织估计每年大约有160万人死于肺炎链球菌的感染[1]。肺炎链球菌的致病性与其荚膜密切相关。根据其荚膜多糖的抗原特性不同，目前已发现46个血清群，90余种血清型[2]。但多数血清型不致病或致病力很弱，仅有少数致病力较强。故而肺炎链球菌血清型流调是评估多价疫苗适用性的必要标准[3]。由丹麦血清研究所（Statens Serum Institut,Denmark）开发的荚膜肿胀和乳胶凝集试剂盒是目前血清型检测使用的传统方法，但其抗血清的价格昂贵且不利于菌株的批量检测。Pai等[4]开发的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）分离样本进行血清分型方法提高了分型的效率。近年来，随着肺炎链球菌荚膜多糖的生物合成基因序列的公布，利用分子学手段进行分型的技术正在逐步走向成熟[5]。

本实验采用多重PCR的方法，对来自儿童患者体内的肺炎链球菌的临床分离株进行血清型鉴定，以确定肺炎链球菌血清型的分布情况，为13价肺炎结合疫苗的开发提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有323株肺炎链球菌临床分离株均由南京市儿童医院检验科微生物室提供，分别于2007年11 月-2011年7月从儿童患者中获得。其中56株是从患者体液内分离得到的菌株，这些患者的临床诊断结果约有50%为肺炎，其余的为中耳炎、化脓性脑膜炎等。由于这些菌株来自于患者体内，故而为侵袭性菌株。其余的267株是从患者的痰液中分离得到的，为非侵袭性菌株。

含10%羊血的哥伦比亚琼脂培养基（Columbia Blood Agar Base,购自OXOID）；三磷酸脱氧核糖苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；引物购自Invitrogen Trading（产地：上海）其他的化学试剂均为国产的分析纯试剂。

1.2 菌体裂解液的制备

将肺炎链球菌的临床分离株涂布于血平板上，于37℃，5%二氧化碳（CO2）培养箱中培养16～20 h[6]。用生理盐水收集平板上的菌体，混匀，离心。将所得菌体用30 μl TE buffer重悬（10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0），沸水浴5 min以保证菌体充分裂解，将菌体裂解液于-80℃保存备 用[7]。

1.3 PCR方法

用于血清分型的30对PCR引物序列引用参考文献[4]设计。以肺炎链球菌细胞裂解液中的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl，其中包括纯化水 15.5 μl，PCR 引物共 2.5 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTPs 2 μl，DNA聚合酶0.5 μl，模板DNA（肺炎链球菌的菌体裂解液）2 μl。PCR反应条件如下：95℃ 4 min，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 10 min，最终降温至4℃。

1.4 PCR产物鉴定

在1.5%琼脂糖凝胶上对所得PCR产物进行凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶的配置和电泳缓冲液菌均采用1×TAE buffer（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）。根据获得的DNA条带大小确定菌株的血清型。

2 结果

2.1 PCR血清分型的条件优化

2.1.1 模板处理方式的优化 本实验比较了模板的不同处理方式对PCR结果的影响，分别以肺炎链球菌菌体和菌体裂解液为模板进行PCR扩增。以14型为例，如图1所示以全菌体为模板时第5组引物无产物，第7组产物条带也较为模糊，而以菌体裂解液为模板时各组产物均成功扩增。结果表明采用菌体裂解液为模板更有助于肺炎链球菌cspA基因的扩增。

2.1.2 退火温度的优化 退火温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，为了比较不同退火温度对PCR结果的影响，本实验将退火温度分别设为50℃、52℃和54℃，其他条件不变分别进行PCR扩增。如图2所示，结果发现退火温度过低（50℃）非特异性条带较多，对最终血清型的确定产生干扰；退火为52℃或54℃均可特异性扩增出肺炎链球菌荚膜多糖条带和分型条带，但鉴于退火温度过高特异性过强不利于目标条带的扩增，故而将最佳退火温度设为52℃。

2.2 样本血清分型鉴定结果

此次实验通过PCR的方法分析了323株肺炎链球菌临床分离株。PCR分型试验结果如图3所示。其中血清型19 F、19 A、14和6 A/B型最为常见，所占的百分比分别为31.3%（101/323）、13.3%（43/323）、12.7%（41/323）和10.8%（35/323），有26株未能分型。根据此鉴定结果，推断7价肺炎结合疫苗的覆盖率约为62%，而13价肺炎结合疫苗（PCV13）的血清型覆盖率较高约为85%。

2.3 侵袭性肺炎链球菌病例分型结果

从患者体内（包括脓液，血液，脑脊液，胸水，分泌物，胸腔积液，支气管肺泡灌洗液等）分离得到的菌株，临床诊断结果约有50%为肺炎，其余的为中耳炎、化脓性脑膜炎等。来自于患者体内的肺炎菌株认定为侵袭性菌株。待测样本中侵袭性菌株共56株，血清分型结果如图4所示。其中19 F、14、19 A、3和6 A/B所占比例较高，分别为37.5%、23.2%、10.7%、7.1%和5.4%，其它7个血清型分别为1、8、17 F、18、20、23 F和33 F，共占16.1%。

非侵袭性菌株共267株，分型结果如图5所示。血清型以19 F、19 A、6 A/B、14和3型为主，所占的比例分别为30.0%、13.5%、12.0%、10.5%和5.6%，有26株未能分型。本次实验结果表明，患者感染侵袭性肺炎链球菌和非侵袭性肺炎链球菌的主要血清型相同，均为19 F、14、19 A、3和6 A/B。这5个血清型共占的比例分别为侵袭性菌株83.9%和非侵袭性菌株71.6%。

图1 模板的不同处理方式对PCR结果的影响

图2 退火温度的优化

图3 肺炎链球菌临床分离株血清型的分布

图4 侵袭性肺炎链球菌分离株的血清型分布

图5 非侵袭性肺炎链球菌分离株的血清型分布

3 讨论

肺炎链球菌在自然界中分布广泛，主要寄生在人的鼻咽部，通过飞沫在人与人之间传播。约有5%～10%的健康成人及20%～40%儿童的鼻咽内带菌,当机体免疫功能较低时病菌就会趁虚而入造成肺炎。目前市场上预防肺炎球菌的疫苗主要有两大类：23价肺炎多糖疫苗和7价多糖蛋白结合疫苗。这些疫苗的开发对肺炎链球菌类疾病起到了很好的控制作用，但随着菌株的变异肺炎链球菌血清型逐渐增加，现有疫苗覆盖率不断降低，且存在地区差异[8]。肺炎多糖疫苗的成本较高、生产工艺复杂且多糖疫苗无法保护婴幼儿，而2岁以下的婴幼儿恰恰是的肺炎链球菌感染的高危人群，所以肺炎结合疫苗的开发将是预防婴幼儿肺炎链球菌类疾病的主要手段。故而建立一种新的简便快捷的方法来鉴定各个地区的肺炎链球菌的血清型，对于评估现有肺炎疫苗的覆盖率和开发新的结合疫苗显得尤为重 要。

相比于传统方法连续多重PCR技术为肺炎链球菌血清型的确定提供了一种更加简单、经济的方法，可以更有效地适应检测各个地区的血清型，为当地肺炎疫苗的覆盖率提供科学依据。目前南非、西班牙等多个国家已采用多重PCR的方法对该地区儿童和成人患者体内的临床分离株进行了血清分型，并选取若干鉴定结果进行测序，测序结果显示与mPCR结果保持一致[9-10]。

本研究建立了多重PCR进行肺炎临床分离株血清分型试验方法，并确定了南京地区儿童患者所携带的肺炎链球菌的血清型，为肺炎疫苗的开发和选择提供了重要依据。

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