变异链球菌groE操纵子及其表达与调控

王一舟 张雅琪 牛雪微 张志民吉林大学口腔医院牙体牙髓病科 长春 130021



变异链球菌groE操纵子及其表达与调控

王一舟 张雅琪 牛雪微 张志民
吉林大学口腔医院牙体牙髓病科 长春 130021

［摘要］变异链球菌耐受口腔内多种环境的变化，主要依赖于多种热休克蛋白基因的表达。其中，groE操纵子表达的GroES-GroEL蛋白可辅助新合成的以及变性的蛋白质折叠、组装、转运和降解，从而影响细胞的代谢。变异链球菌groE操纵子位于1 834 692～1 832 649位点，包括σA型启动子、分子伴侣表达反向重复序列（CIRCE）、groES和groEL及终止子，在进化上高度保守，其表达受热、酸、乙醇和过氧化氢等多种应激环境的诱导，受CtsR 和HrcA蛋白的双重负性调节。groE操纵子的调控有HrcA-CIRCE系统负调控假说和CtsR的负调控两种方式，但其具体调控机制尚未在变异链球菌中得到充分证实。从分子水平上研究变异链球菌groE操纵子的结构和调控机制，有助于进一步阐明细胞的生理过程，为了解细胞在应激和病变状态下的分子调节机制打下基础。

［关键词］变异链球菌；groE操纵子；热休克蛋白基因；调控

变异链球菌是口腔主要致龋菌，定植于人类牙面菌斑生物膜，可承受持续的宿主防御反应并适应口腔内急剧的环境变化，包括可利用的营养、糖类和酸碱度变化［1］。变异链球菌已演化出多种生理和遗传适应性，使其在动态环境中获得最优化的生长［2］，其中包括分解代谢多种糖类，耐受应激环境尤其是酸环境的能力［3］，而这种能力主要取决于细菌多种热休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因的表达［4］，包括现研究较为深入的groE操纵子。groE操纵子可表达出GroEL分子伴侣，辅助新合成的以及变性的蛋白质折叠、组装、转运和降解，从而影响细胞的代谢［5］。本文就变异链球菌groE操纵子的结构、表达和调控等研究进展作一综述。

1　 groE操纵子的结构

1.1groE操纵子的分子结构

groE操纵子结构有高度保守性，一般含groES 和groEL两个结构基因，且多数具有相同的顺序［6］。变异链球菌groE操纵子基因查找于基本局部比对搜索工具，位于1 834 692～1 832 649位点，与dnaK操纵子具有相反的转录方向，包括σA型启动子、分子伴侣表达反向重复序列（controlling inverted repeated of chaperone expression，CIRCE）、groES和groEL及终止子。groES基因（288 bp）编码含有95个氨基酸相对分子质量为1.0×104的多肽。groEL基因（1 626 bp）编码含有542个氨基酸相对分子质量为5.7×104的多肽。两基因相距111 bp。距离groES转录起始位点5’端48个核苷酸处有一个单独的转录起始点（PgroE），距离5’端57个核苷酸处有一个σA型启动子（TTGACT-N6-TACAAT）。以groEL基因片段为探针的RNA印迹法分析显示出一个2.1 kb的单独转录印记，而预期的groEL-ES双顺反转录产物的分子大小约为2.1 kb。即groEL能由PgroE实现与groES共转录。CIRCE起始于距离-10元件3’端11 bp处，终止于距groES起始密码子19 bp处，是具有高度保守型性的发夹结构［7］。

1.2groE操纵子的保守性

groE操纵子在链球菌中有高度同源性。Hung等［8］通过对5种链球菌的8个血清型菌株groE操纵子进行一些列研究发现，groES序列的核苷酸一致性为61.5%～100%，他们推定其蛋白质的氨基酸一致性为53.7%～100%。其中，变异链球菌的3种血清型与表兄链球菌（旧称远缘链球菌）d、g血清型有最高的相似性；而groEL序列则具有77.7%～99.9%的核苷酸一致性及90.5%～100%的氨基酸一致性。groES和groEL的间隔具有菌种特异性，范围为111～310 bp，其中变异链球菌最小为111 bp；而位于结构基因上游的CIRCE元件则广泛地存在于细菌中，且具有高度保守性［9］。

2　groE操纵子的表达与调控

2.1groE操纵子的表达

groE操纵子的表达可被多种环境刺激因素诱导，包括热、酸、乙醇和过氧化氢刺激等［10］。在结肠埃希菌（俗称大肠杆菌）中，不同于dnaK操纵子仅对细菌耐受高温和低温环境（＞37 ℃或＜15 ℃）有重要的作用，groE操纵子对细菌在各种温度下存活都具有重要意义［11］。变异链球菌酸应激时，groEL的高表达并不能持久，groEL mRNA 1 d内增加约2.5倍（pH5.0），而后质量降低至稳定状态时二者并无明显差异［12-13］。Lim等［14］发现，光动力治疗亦能诱导groE操纵子的表达，其方式类似于渗透应力。

2.2groE操纵子的调控

groE操纵子的调控在许多细菌及真菌中已有广泛研究：结肠埃希菌中需要含有σ32和σE亚基的RNA聚合酶来实现hsp基因反应的调控［15］；枯草杆菌则含有4类hsp基因，属于第一类hsp基因的如dnaK和groE基因，受HrcA-CIRCE系统负调控；如clpP和clpC基因属于第三类hsp基因，受CtsR的负性调节［16］。也曾有研究显示，低G+C革兰阳性细菌，如乳酸杆菌、变异链球菌和酿脓链球菌，其dnaK和groE操纵子hsp基因反应受到HrcA和CtsR蛋白的双重负性调节。

2.2.1HrcA-CIRCE系统负性调控假说早在1989年，Baird等［17］就在结核双歧杆菌中发现了groE操纵子上游含有反向重复序列，但数年之后的研究才证实该反向重复序列是一个热休克调控元件，广泛地存在于细菌、真菌、衣原体和支原体［9，18-20］等微生物中。Zuber等［21］因groE与dnaK操纵子有密切联系而将其命名为CIRCE元件。阻遏蛋白HrcA的编码基因位于dnaK操纵子，在其转录翻译并由核糖体释放后即处于失活状态（Hi），不能与操纵子结合，需要GroE分子伴侣通过酶修饰作用使其复活（Ha）。Ha可以识别并能够结合于特定位置的CIRCE元件，从而抑制groE的转录。随着GroE质量下降，HrcA以一定速率变回Hi并脱离CIRCE元件［22］。在常温条件下，GroE系统使大多数HrcA以Ha形式存在，Ha与groE和dnaK操纵子前端的CIRCE结合，造成操纵子的低水平转录。在热刺激下，HrcA松开与CIRCE的结合，dnaK和groE操纵子高水平转录，分子伴侣在5 min内快速增加4～6倍至峰值，同时hrcA作为dnaK操纵子的第一个编码基因，Hi大量形成。随着groEL基因的转录，形成的大量GroEL又帮助Hi正确折叠复活，从而抑制转录，分子伴侣下降并维持新的稳定状态。一次HSP反应结束，耗时5～10 min［23］。

GroEL到底是通过什么方式调控HrcA的活性的，理论上有三种假想：1）HrcA是GroE的底物，需要分子伴侣使其正确折叠或多聚化；2）GroE能影响一个目前未知的蛋白质，而该蛋白质能够活化HrcA；3）HrcA脱离其操纵子后形成聚合物，需要GroE使其重新分离。在体外，GroEL阻抑HrcA的聚合，证明GroEL能与阻遏物直接相互作用，无需影响其他蛋白质［24］；因此，人们更倾向于第一种假说；当然，这不排除在体外有其他蛋白质能调控HrcA和GroEL间的相互作用。Chen等［25］发现支原体HrcA具有特殊的C-末端，能与GroEL结合形成复合物，从而大大增强HrcA与CIRCE的结合。在变异链球菌中，HrcA和GroEL间的相互作用机制尚在研究之中。

Lemos等［26］通过定向敲除dnaK和groE基因的方法制备了SM12和SM13两种变异链球菌突变体，在SM12中DnaK蛋白降低了95%，在SM13中GroEL蛋白降低了80%。他们发现，SM12中的GroEL蛋白水平是亲代的2倍，dnaK中的HrcA蛋白对groE基因表达有负调控作用。

2.2.2CtsR的负性调控CtsR被发现于枯草芽孢杆菌，通过与同向重复序列（A/GGTCAAA-NANA/GGTCAAA）相结合，阻抑第三类hsp基因的表达［27］。而后的研究发现，在一些低G+C革兰阳性细菌中，CtsR亦能调控hsp18及其dnaK基因的表达。还发现了受到CtsR和HrcA蛋白双重调控的基因，即金黄色葡萄球菌的dnaK操纵子及唾液链球菌的clpP基因［28-29］，它们同时具有CtsR和HrcA的识别序列［16］。在肺炎双球菌中，Chastanet等［30］发现，ctsR能与groESL启动子结合，但结合元件并不同于以往的认知。对比肺炎双球菌与变异链球菌groESL基因，发现了几乎相同的CtsR结合目标序列，这就有力地支持了在变异链球菌中CtsR能负调控groESL基因。这也与之后在clpC和clpP基因突变株中的试验结果相符合［31］，但其具体调控机制尚未在变异链球菌中充分证实。

综上所述，变异链球菌groE操纵子是在进化上高度保守的基因，其表达受多种应激环境的诱导，包括热、酸碱度、过氧化氢和乙醇等。目前认为，其表达受CtsR和HrcA蛋白的双重负性调节，但CtsR的具体调控机制尚未在变异链球菌中得到证实。从分子水平上研究变异链球菌groE操纵子的结构及调控机制，有助于进一步阐明细胞的生理过程，为了解细胞在应激、病变状态下的分子调节机制打下基础。

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（本文采编 王晴）

The groE operon of Streptococcus mutans with its expression and regulation

Wang Yizhou，Zhang Yaqi，Niu Xuewei，Zhang Zhimin.（Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun 130021，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（81170945）.

［Abstract］Streptococcus mutans（S.mutans），as one of the primary cariogenic bacteria，can respond to several environmental stresses.This ability mainly depends on the translation and expression of variety of heat shock protein genes.groE operon，one of the best-studied heat shock genes，affects the metabolism of cells by translating the heat shock proteins，groES-groEL，which can mediate the folding，assembly，transport，and degradation of new or misfolding proteins.The groE operon locates in 1 834 692-1 832 649 sites，including a σApromoter，inverted repeat sequence（CIRCE），groES，groEL and a terminator.It is highly conserved，and can be induced to express by stress environment including heat，acid，ethanol and hydrogen peroxide.Both HrcA-CIRCE system and CtsR play a negative regulation role，without a clear mechanism.Studies，about the structure and regulation mechanism of S.mutans groE operon in a molecular level，help to further clarify the physiological process of cells，and lay the foundation for understanding the molecular mechanism of cells under stress and pathological conditions.

［Key words］Streptococcus mutans；groE operon；heat shock protein gene；regulation

［收稿日期］2015-06-27；［修回日期］2015-12-09

［基金项目］国家自然科学基金（81170945）

［作者简介］王一舟，硕士，Email：451454855@qq.com

［通信作者］张志民，教授，博士，Email：zhangzm1964@sina.com

［中图分类号］Q 786

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.021