变异链球菌临床株表面相关蛋白表达差异的初步分析

赵兴福江山黄晓晶闫福华.南开大学口腔医院•天津市口腔医院牙体牙髓病二科 天津 0004；.福建医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科 福州 5000；.南京大学医学院附属口腔医院高级专家诊疗科 南京 0008



变异链球菌临床株表面相关蛋白表达差异的初步分析

赵兴福1江山2黄晓晶2闫福华3
1.南开大学口腔医院•天津市口腔医院牙体牙髓病二科 天津 300041；
2.福建医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科 福州 350002；
3.南京大学医学院附属口腔医院高级专家诊疗科 南京 210008

［摘要］目的探讨变异链球菌临床株在中性条件下表面相关蛋白的表达差异，进一步了解龋病的发生和发展过程。方法在pH7.0条件下采用Homer法提取临床分离株的表面相关蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和二维电泳（2DE）确定蛋白质表达的差异条带及位点，差异位点由基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析，并结合数据库进行检索和鉴定蛋白质。结果经过对电泳图谱的分析发现：593号菌株存在14个高表达蛋白质位点和8个特异蛋白质位点，其中丙酮酸激酶、ABC运载体（腺苷三磷酸结合蛋白）特异表达，葡糖基转移酶高表达。结论两菌株在中性条件下出现了某些蛋白质的高表达和特异表达，可能是致龋性存在差异的原因。

［关键词］变异链球菌；蛋白质组学；临床分离株；表面相关蛋白

龋病是世界范围内的常见病和多发病，变异链球菌血清型C型菌株是与龋关系最密切的致龋菌之一，并有研究［1-2］表明该菌株临床分离株间致龋性存在明显差异。于是，在前期研究中本课题组从高龋患者和无龋健康人成功分离血清C型变异链球菌的临床分离株，并发现菌株间黏附能力、产酸能力、胞外多糖合成能力、耐酸能力存在明显差异［3］。本研究旨在通过对菌株间表面相关蛋白的蛋白质组学差异的初步分析，进一步探讨菌株间致龋性存在差异的原因。

1　材料和方法

1.1材料与设备

胰蛋白胨-多价蛋白-酵母提取物培养基（tryptone-pdypeptone-yeast extract，TPY）（1.5%胰蛋白胨，0.4%酵母提取物，1%葡萄糖，0.6% KH2PO4，0.2% K2HPO4·3H2O，0.2% Na2CO3，0.2% NaCl，pH=7.0自配）；两性洗涤剂（Sigma公司，美国）；两性电介质（Thomas Global公司，美国）；透析袋（Pierce公司，美国）；0.22 μm滤膜（Acrodisc公司，德国）；固相pH梯度胶条（Bio-Rad公司，美国）；蛋白标志物（厦门泰京生物科技有限公司）；固相pH梯度干胶条覆盖液（Bio-Rad公司，美国）；苯甲基磺酰氟（phenyl methanesulfonyl fluoride，PMSF）（深圳赛泰克生物科技有限公司）；碘乙酰胺（iodacetamide，IAM）（Amersham公司，美国）；二硫素糖醇（dithiothreitol，DTT）（Genview公司，美国）；固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）缓冲液（pH3-10NL）（Bio-Rad公司，美国）；低分子量标准蛋白（Sigma公司，美国）；银染试剂盒（Bio-Rad公司，美国）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（江苏省碧云天生物技术研究所）；YQX-Ⅱ厌氧培养箱（上海新苗医疗器制造有限公司）；IPGphor等电聚焦仪（Amsheram Pharmacia公司，美国）；DYY-6C型电泳仪 （北京市六一仪器厂）；ETTAN Ⅱ垂直板电泳仪（Amsheram Pharmacia公司，美国）；全自动酶联免疫测定仪（Human公司，德国）；Power Look 2100xl凝胶成像仪（扫描仪）（Amsheram Pharmacia公司，美国）；GE50超声处理器（Deerfield公司，美国）；图象分析软件ImageMaster 4.01（Amsheram Phar-macia公司，美国）；320-S型p H计（Mettlertoledo公司，瑞士）；ND-1000分光光度计（DanoDrop公司，美国）。

1.2菌株

选用的变异链球菌临床分离株分别是来源于高发龋患者的593号菌株和来源于无龋健康人的18号菌株，由本课题组于四川大学华西口腔医学院龋病研究室分离、鉴定及保存，并经体外致龋实验证实593号菌株的产酸能力、黏附能力、合成胞外多糖的能力和耐酸能力均强于18号菌株［3］。

1.3生长曲线测定

在TPY固体培养基上将冻干粉保存的菌株复苏，厌氧（80% N2、10% H2、10% CO2）、37 ℃、24 h后传二代，将平板菌落用无菌消毒棉签分别收集于预消毒好的TPY培养液（pH7.0）中，通过光密度（optical density，OD）（A630）调节菌密度均为1.0左右，然后分别以体积比5：100加入预消毒好的TPY（pH7.0）液体培养液中，旋转混匀，分装于小试管中，置厌氧条件下37 ℃培养，每小时将2支小试管取出，各测3次OD值后取平均值，列图表，绘生长曲线，确定对数生长期。

1.4Homer法提取表面相关蛋白

593号和18号菌株常规复苏、传代，将平板菌落用无菌消毒棉签分别收集于预消毒好的TPY （pH7.0）培养液中，通过OD（A630）调节菌浓度均为1.0左右，分别以体积比5：100加入预消毒好的TPY（pH7.0）液体培养液中，旋转混匀，厌氧37 ℃培养，对数生长期时停止培养。将菌液离心（4 000 r·min-1，5 min），重悬于磷酸盐缓冲液（public broadcasting service，PBS），用吸管轻轻吹打混匀，离心（4 000 r·min-1，5min），再重悬于PBS液，用吸管轻轻吹打混匀，收集于一处，通过OD（A630）调整菌浓度为0.9，将该菌液离心（4 000 r·min-1，5min），重悬于1/5体积含质量体积比0.2：100 Zwittergent 3-12的PBS液，轻轻吹打混匀，分装于Ep管中，孵育（50 r·min-1，1 h，25 ℃），离心（13 000 r·min-1，10 min），上清液收集于一处。将上清液加入4倍体积的50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.5），混匀，0.22 μm过滤器过滤，分装于蛇皮袋（snakeskin）于新鲜配制的50 mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5）中透析，4 ℃，磁力慢速搅拌，过夜。将4倍体积-70 ℃预冷的丙酮加入透析液，-20 ℃，过夜，离心（12 000 r·min-1，20 min，4 ℃），干燥，于50 mmol·L-1Tris-HCl （pH=7.5）中重悬，4倍体积-70 ℃预冷的丙酮加入重悬液，-20 ℃，过夜，离心（12 000 r·min-1，20 min，4 ℃），干燥，保存于-70 ℃。

1.5蛋白样品BCA法定量及十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳分析

将蛋白质样品溶解，用CurveExpert 1.3软件计算蛋白质浓度，并将蛋白质制备成浓度一致的样本。分别取适量的蛋白质样品，混匀于1/4体积5倍加样缓冲液中，沸水（100 ℃）浴10 min，离心（12 000 r·min-1，10 min）。用12%分离胶和5%积层胶采取垂直不连续板状法进行SDS-PAGE电泳，制备7 cm×7 cm凝胶。将等量蛋白质样品上样，30 mA，约4 h冰浴。考马斯亮蓝溶液中将电泳完毕的凝胶染色，置脱色液（10%乙酸-5%乙醇）中脱色，观察电泳结果，照相。

1.6蛋白样品改良的Bradford法定量及二维电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）分析

改良的Bradford法绘制标准曲线，计算出蛋白质样品溶解液蛋白质含量。根据样品的具体情况和所选择的strip条带长度、pH梯度范围选择上样量，再根据上样量确定样品体积，上样后根据pH范围和strip的长度设定等电聚焦电泳参数，在电泳中应随时监测电压的情况，若电压不达到要求，电泳时间要适当延长，必须达到所要求的伏小时数。电泳结束，取出strip条带，进行平衡，或-80 ℃保存于塑料管内。二次胶条平衡后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束取出凝胶，银染，于1%冰乙酸中将染色好的凝胶脱色，4 ℃保存，照相。用软件ImageMaster 2D Platinum 5.0对染色好的凝胶胶图蛋白质表达量差异点进行分析。

1.7差异蛋白质位点的基质辅助激光解析电离飞

行时间（matris assisted laser desorption ionizationtime of flight，MALDI-TOF）质谱分析选取及切取差异蛋白质位点，放置于洁净Ep管，准备阴阳性对照，将切取的差异蛋白质位点用胰蛋白酶消化，MALDI-TOF质谱法分析差异蛋白质位点，得到各蛋白质位点的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting，PMF），在NCBInr数据库中用Mascot（http：//www.matrixscience.cn）软件检索相匹配的蛋白质。

2　结果

2.1在pH7.0条件下两菌株TPY液体培养基中的生长曲线

593、18号菌株在pH7.0 TPY液体培养基中的生长曲线详见图1：在pH7.0液体培养基中两菌株接种后无停滞期，生长迅速，4 h左右便进入对数生长期，由于菌间黏附在生长到一定阶段时出现沉积，但593号菌株生长稍快于18号菌株，早0.5 h左右出现黏附沉积。

图1　593、18号菌株在pH7.0 TPY液体培养基中的生长曲线Fig1　The growth curve of Streptococcus mutans 593 and Streptococcus mutans 18 at pH7.0 in TPY fluid medium

2.2两菌株表面相关蛋白SDS-PAGE电泳结果

593和18号菌株在pH7.0条件下表面相关蛋白质的SDS-PAGE电泳结果详见图2：593号菌株在36、38、110 ku左右存在特异条带，在28 ku左右蛋白质表达量比18号菌株大，18号菌株在16、32 ku左右的蛋白质表达量比593号菌株大。

图2　在pH7.0条件下593号菌株和18号菌株表面相关蛋白的SDSPAGE电泳图Fig2　The surface-associated protein electrophoresis of clinical-isolated Streptococcus mutans 593 and Streptococcus mutans 18 at pH7.0 by SDS-PAGE

2.3两菌株表面相关蛋白2DE结果

593和18号菌株在pH7.0条件下表面相关蛋白的2DE结果详见图3。

图3　593号菌株在pH7.0条件下表面相关蛋白的2DE电泳图Fig3　The surface-associated protein electrophoresis of Streptococcus mutans 593 at pH7.0 by 2DE

通过ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对593 和18号菌株在pH7.0条件下表面相关蛋白的2DE图分析后发现：593号菌株存在14个高表达蛋白质位点和8个特异蛋白质位点，其中，在36、38 ku左右存在841、958、973、1021等高表达蛋白位点和669、853、907、935、975、982等特异蛋白位点，同时在28 ku左右存在1070、1074、1152、1161等高表达蛋白位点和1097、1121等特异蛋白位点。18号菌株存在4个高表达蛋白位点和9个特异蛋白位点，其中，18号菌株在16、32 ku左右存在964、1046等高表达蛋白位点和875、963、1099、1136、1203等特异蛋白位点。

2.4部分特殊蛋白位点质谱分析结果

MALDI-TOF质谱法得到669、1074、1097蛋白位点的PMF，在NCBInr数据库中用Mascot软件根据各蛋白位点的PMF检索相匹配的蛋白，结果发现：669点为丙酮酸激酶，1074点为葡糖基转移酶，1097点为ABC运载体（ATP结合蛋白）（表1）。

表1　593号菌株部分表面相关蛋白的鉴定结果Tab1　The identification result of the surface-associated protein of Streptococcus mutans 593

3　讨论

变异链球菌是多数学者公认的主要致龋菌，是牙菌斑生物膜的重要组成成分，以及具备在牙面定植的多种特性，在人类口腔中占有重要的生态地位。研究［4］发现：革兰阳性菌的膜表面具有许多与细菌毒力因子相关的重要蛋白。革兰阳性变异链球菌膜表面相关蛋白同样含有许多毒力因子相关蛋白［5］，与其致龋性密切相关。因此，笔者推测研究此类蛋白可能会有助于深入了解变异链球菌致龋的发生和发展过程。

浮游状态下变异链球菌在对数生长期的代谢能力强，死菌数量低，且Wilkins等［6］通过比较提取变异链球菌膜表面相关蛋白发现：在对数时期蛋白相对完整，以及蛋白纯度不会受细菌裂解的影响，可重复性好。593号菌株和18号菌株在pH7.0条件下的生长曲线显示：两菌株在4 h左右开始进入浮游状态下的对数生长期，因此本实验拟提取两菌株4 h左右的膜表面相关蛋白，但593号菌株生长稍快于18号菌株，出现沉积物要早于18号菌株，这可能提示593号菌株的代谢能力强于18号菌株，与前期研究结果一致［3］。

SDS-PAGE电泳是蛋白分析中最常用的方法之一，其原理是根据蛋白质分子量大小而分成迁移率不同的条带，并经染色液染色后用肉眼即可观察，同时其获得的电泳图谱有助于蛋白组学差异初步分析。再者，2DE是可将数千种蛋白同时分离与展示的分离技术，是蛋白组学和差异蛋白组学研究中的首选分离技术［7］。

本研究通过采用SDS-PAGE和2DE分析593号和18号菌株在中性条件下膜表面相关蛋白发现：两菌株蛋白表达存在明显差异。SDS-PAGE结果显示：593号菌株在36、38 ku左右存在特异条带，与此相符的是在2DE结果亦显示在36、38 ku左右存在特异蛋白位点，但2DE同时还发现在此区域又出现了高表达蛋白位点，分析其原因可能与2DE中所用的银染分辨率高于SDS-PAGE中所用的考马斯亮蓝染色有关。另外，2DE结果还显示：593号菌株在28 ku左右蛋白表达量大于18号菌株，同时此区域亦存在高表达蛋白位点和特异蛋白位点。其中，葡糖基转移酶高表达，丙酮酸激酶、ABC运载体（ATP结合蛋白）特异表达。

合成胞外多糖的能力是变异链球菌致龋的重要条件之一。变异链球菌产生的葡糖基转移酶可利用蔗糖合成细胞外多糖。细胞外多糖可促进变异链球菌在牙面的附着以及变异链球菌之间的集聚，同时在维持生物膜结构、提供营养等方面均有重要作用。有研究表明：在同一pH条件下，不同龋敏感口腔变异链球菌葡糖基转移酶的活性存在差异，龋敏感性越高，葡糖基转移酶活性越大。本研究中，593号菌株葡糖基转移酶蛋白表达量是18号菌株的9.1倍，可见593号菌株合成胞外多糖能力远大于18号菌株，导致了593号菌株致龋能力远大于18号菌株，与本课题组前期研究结果一致［8］。再者，丙酮酸激酶和ABC运载体（ATP结合蛋白）在593号菌株特异表达。丙酮酸激酶是变异链球菌糖酵解的关键酶，其特异表达可能使得593号菌株的糖酵解能力强于18号菌株。另外，研究发现：结合蛋白ABC运载体可与ATP结合，其与该菌的耐酸能力、黏附能力、与其他细菌的竞争能力、抵抗外界环境或者宿主免疫能力等密切相关。可见，这些蛋白特异表达可能导致593号菌株上述相应能力强于18号菌株。

综上所述，变异链球菌临床分离株菌株间致龋性存在差异与菌株间蛋白表达差异密切相关。至于该菌株临床分离株在各种应激条件下的蛋白表达变化以及各蛋白间协调作用情况还有待深入研究。

4　参考文献

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Zhao XF，Huang XJ，Cai ZY，et al.Proteins differences between Streptococcus mutans strains isolated from caries-active and caries-free individuals by SDS-PAGE［J］.Oral Sci Res，2008，24（2）：127-130.

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［7］Rabilloud T.Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics： old，old fashioned，but it still climbs up the mountains［J］.Proteomics，2002，2（1）：3-10.

［8］黄晓晶，刘天佳，杨锦波，等.高龋及无龋者变形链球菌临床分离株致龋性研究Ⅱ：合成细胞外多糖能力的实验研究［J］.华西口腔医学杂志，2000，18 （6）：419-421.

Huang XJ，Liu TJ，Yang JB，et al.Evaluation of cariogenic potential of Streptococcus mutans isolated from caries-free and -active persons：abilities to synthesize water-soluble and -insoluble glucans［J］.West China J of Stomatol，2000，18（6）：419-421.

（本文编辑王姝）

Differential expression of surface-associated proteins in clinical isolations of Streptococcus mutans

Zhao Xingfu1，Jiang Shan2，Huang Xiaojing2，Yan Fuhua3.（1.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics II，Tianjin Stomatological Hospital，Stomatological Hospital of Nankai University，Tianjin 300041，China；2.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Hospital of Stomatology，Fujian Medical University，Fuzhou 350002，China；3.Dept.of Senior Expert Diagnosis and Treatment，Hospital of Stomatology，Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（30500564）.

［Abstract］ObjectiveThis study aims to investigate the changes in the expression of surface-associated protein at pH7.0 in Streptococcus mutans isolated from clinical samples.MethodsThe proteins were extracted from the cells at pH7.0 by using the Homer method.The proteins were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE） and 2D gel electrophoresis（2DE） followed by image analysis.The proteins were identified by matrix-assisted laser desorption time of flight（MALDI-TOF） mass spectrometry and computer-assisted protein sequence analysis.Results Image analysis revealed that 14 high expression protein loci and 8 specific protein loci exist in Streptococcus mutans 593.Specifically，pyruvate kinase and adenosine triphosphate-binding cassette transporter were modulated，and glucose transferase was highly modulated in Streptococcus mutans 593.ConclusionThe difference in protein expression of the two clinical isolations may indicate their distinct cariogenic characters.

［Key words］Streptococcus mutans；proteomics；clinical isolation；surface-associated protein

［收稿日期］2015-06-12；［修回日期］2015-11-16

［基金项目］国家自然科学基金（30500564）

［作者简介］赵兴福，主治医师，硕士，Email：xingfu_108@126.com

［通信作者］黄晓晶，教授，博士，Email：hxiaoj@163.com

［中图分类号］Q 51

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.005